SN_T 3979-2014乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定方法杯碟法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3979—2014乳及孚制品中β-内酰胺酶的测定方法杯碟法Determination of penicillinase in milk and dairy products-Cylinder plate method2014-07-14 发布2015-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3979—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中心、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、西南大学本标准主要起草人：李应国、薛晓晶、李玲、金涌、周庆、聂福平、肖进文、田世民、李贤良、王国民、田晋红、龙再浩I SN/T 3979--2014乳及乳制品中-内酰胺酶的测定方法杯碟法1范围本标准规定了生鲜乳及其制品中以舒巴坦为抑制剂的β-内酰胺酶的微生物学测定方法（杯碟法）。本标准适用于生鲜乳、纯牛奶、酸奶、奶粉等中β-内酰胺酶的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3　方法原理该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，在样品中加人青霉素G作为对照，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，通过比对加人舒巴坦与未加人舒巴坦的样品所产生抑菌圈的大小，来间接测定样品中是否含有β-内酰胺酶类药物。4试剂和材料除特殊规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。4.1标准菌株：藤黄微球菌（Micrococcus luteus)CMCC(B)2800l，传代次数不得超过14次。4.2脱脂奶粉或牛体乳。4.3青霉素G(Benzylpenicillin Potassium G tetrahydrate)标准品：纯度大于或等于 99%;CAS号：113-98-4;相对分子质量：:372.48;分子式C16H17KN²O4S。4.4　β-内酰胺酶(Penicillinase)标准品1):CAS号:9001-74-5。4.5舒巴坦（Sulbactam）：纯度：99.4%；CAS号：68373-14-8；相对分子质量：233.24；分子式：C. Hu NO, S.4.60.1 mol/L Tris-HCl溶液(pH 7.0,含 0.1%BSA):按 A.1 配制。4.7磷酸盐缓冲溶液（pH6.0）：按A.2配制。4.8青霉素 G标准品溶液:按 A.3配制。4.9β-内酰胺酶标准品溶液：按A.4配制。4.10舒巴坦溶液：按A.5配制。4.11营营养琼脂：按A.6配制。4.12脑心浸液培养基：按 A.7配制。1）β-内酰胺酶是由SIGMA公司提供的产品。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品均有相同效果，则可使用这些等效产品。1 SN/T 3979—20144.13抗生素检定培养Ⅱ号（低 pH）:按 A.8配制。4.14 0.2 μm滤膜。5仪器和设备5.1天平（感量0.0001g）。5.2微型振荡器。5.3恒温培养箱：（36士1)℃。5.4高压灭菌器。5.5麦氏比浊仪或标准比浊管。5.6 pH计。5.7测量尺（精度0.1mm)或相同作用的检测仪（精度0.02mm）。5.8无菌培养Ⅲ：内径90 mm，底部平整光滑的玻璃Ⅲ，具陶瓦盖。5.9无菌牛津杯：外径（8.0±0.1)mm，内径（6.0±0.1)mm，高度（10.0±0.1)mm。5.10²无菌吸管：1 mL(0.0l mL刻度值）,10 mL(0.1 mL刻度值）。5.11加样器:5 μl～20 μI,20 μL～200 μL,200 μl～l 000 μL 及配套吸头。6操作步骤6.1菌悬液的制备将藤黄微球菌划线接种于营养琼脂平板上，经（36士1)℃培养24h～36h至长出单菌落，4℃保存，存贮期限28d。挑取单菌落于灭菌的5ml.脑心浸液培养基中，经（36土1）℃培养20 h～24h至菌液浑浊，测定菌悬液浓度,终浓度应为 1×10°CFU/mL～1×10°CFU/mI，可供 5d 内使用。6.2检测用平板的制备菌悬液按1：20加人到无菌的大约50℃抗生素检定培养基IⅡI号中，充分摇勾。取90mm无菌培养Ⅲ，加人（15士1)mL含菌的抗生素检定培养基I号，凝固后在其表面放置4个无菌牛津杯，备用。6.3样品的制备将待检样品充分混匀,取1mI.待检样品置于1.5mL离心