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丙酮浸提法提取植物叶片叶绿素的研究 叶色是反映树木健康状况的最常用生理指标之一。能够用来提取叶绿素的有机溶剂,如氯仿、石油醚、二甲基甲酰胺、乙醇、丙酮、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)等 1 材料和方法 1.1 筛选适合自己叶片叶绿素含量测定的新方法 采用小麦(Triticum aestivum)、油菜(Brassica campestris)、油松(Pinus tabuiaeformis)、毛白杨(Populus tomentosa)等4种植物的叶片为实验材料,比较和筛选适合树木叶片叶绿素含量测定的方法。其中小麦和油菜叶片用于分析三种测定方法差异性产生的原因。 1.2 提取方法 1.2.1 油松针的制备 用直径为0.9 cm的打孔器将小麦、油菜、杨树等植物的叶片钻取2个叶圆片,切成宽度为1 mm的细丝;油松针叶称取100 mg,切成1 mm的小段。上述材料放入10 m L具塞试管中,直接用10 m L80%丙酮4℃下暗处浸泡提取一周,至叶片无色或白色,然后测定叶绿素溶液在663.6 nm、646.6 nm处的吸光度。 1.2.2 80%丙酮研磨提取方法以下简称研磨法 按1.2.1的方法钻取叶圆片10片,或称取油松针叶0.5 g,置于预冷的研钵中,加入少许Ca CO 1.2.3 dmso5前处理 按1.2.1的方法将植物材料放入10 m L具塞试管中,先用2 m L DMSO 65℃下避光提取至叶片完全褪色(约需0.5~3 h),然后用8 m L 80%丙酮稀释并混匀,然后测定663.6 nm、646.6 nm处的吸光度。 1.3 计算中的绿色成分含量 浸提法和研磨法用Porra等人(1989)的修订公式 2 结果与分析 2.1 种方法测定叶绿素含量 在研究叶绿素快速提取与精密测定实验中(邱念伟等2016),我们以同等质量或面积的植物材料,分别用三种方法提取叶绿素,测定663.6 nm、646.6 nm处的吸光度后,代入各自的叶绿素含量计算公式,发现三种方法测定小麦、油菜的叶绿素含量,叶绿素总含量和叶绿素a/b相差不大。但是杨树叶片和松树叶片叶绿素含量差异极大,用丙酮浸提法测定的杨树叶绿素含量比两步法和研磨法分别低28.3%和25.9%;而松树分别低18.4%和13.2%。三种测定方法测定结果差异较大,影响实验结果的可靠性。分析这一差异产生的原因,对准确测定树木叶片的叶绿素含量具有重要意义。 2.2 不同种类植物叶片叶绿素含量的测定 丙酮浸提法测定树木叶片的叶绿素含量结果偏低很有可能是由于浸提时间不够,提取不完全导致。为此,我们取同等质量或面积的植物材料,放入具塞试管中,用10 m L 80%丙酮在4℃下浸提不同时间,测定叶绿素含量的变化。结果显示4种植物叶片的叶绿素含量大约在2~4天内被完全提取,超过4天,叶绿素含量不再增加,说明叶绿素已经提取完全。杨树叶片用80%丙酮浸提了7天,所以浸提法测定结果偏低不是由于提取时间短,叶绿素未完全提取造成的。 2.3 叶绿素降解试验 由于丙酮浸提法需要时间过长,其测定结果偏低也有可能是长时间提取过程中叶绿素降解造成的。我们将上述材料完全提取的叶绿素溶液放置在4℃冷藏冰箱中保存1~7天,每天测定叶绿素浓度变化,计算叶绿素含量,观察叶绿素降解情况。叶绿素溶液在4℃下保存7天后,仅有微弱的降解。杨树和油松叶绿素含量分别仅下降了2.86%和2.37%。而浸提法测定结果比研磨法或两步法低13%~28%(表1)。 2.4 丙酮浸提法提取叶绿素 叶绿素是否从叶片中完全提取,可以从提取残渣的颜色进行判断。小麦和油菜用三种方法提取后,残渣呈白色半透明状或白色粉末(表3),说明这两种植物的叶绿素已被完全提取。但杨树用80%丙酮浸提7天后,残渣仍然呈褐色;油松的残渣则呈浅黄色。用两步法或研磨法提取杨树和油松的叶绿素,残渣则为白色半透明状或白色粉末。浸提法的残渣再用DMSO 65℃高温提取,并无绿色物质溶出,也证明浸提法可以将叶绿素完全溶出,残渣中已无叶绿素。根据上述现象,我们推测,浸提法残渣中的有色物质可被DMSO高温提取或者研磨提取,从而可能会对叶绿素a和b的吸光度具有显著干扰,导致两步法和研磨法吸光度测定结果偏大。 2.5 丙酮浸提法提取有色中有色物质 浸提法的杨树叶片残渣中的褐色物质用DMSO高温65℃下浸提,褐色物质仍然无法溶出;但在高温65℃下DMSO能溶出松树残渣中的黄色素,使油松残渣变白。将杨树的褐色残渣用DMSO研磨提取,则能溶解出部分褐色物质,残渣变成浅褐色粉末。将两种树木叶片的有色残渣按照上述两种办法分别用DMSO提取,然后再用80%丙酮稀释。DMSO和80%丙酮的用量与叶片样品完全一致,然后测定有色干扰物质在663.6 nm和646.6 nm处的吸光度。表4