SNT 2131.1-2008进出口贝类中腹泻性贝类毒素检测方法 第1部分：荧光磷酸酶抑制法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2131. 1-2008进出口贝类中腹泻性贝类毒素检测方法第1部分：荧光磷酸酶抑制法Determination of DSP in shellfish for import and export-Part 1 : Inhibition method of fluorescence phophatase activity2009-03-16 实施2008-09-04 发布中华人民共和国6条质技197616查真伤发布数码防伪“国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2131. 1—2008前言本部分是SN/T2131的第1部分。本部分的附录A为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吴斌、李叶、王玉萍、李振荣、谢炎。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2131. 1—2008进出口贝类中腹泻性贝类毒素检测方法第1部分：荧光磷酸酶抑制法1范围SN/T2131的本部分规定了贝类中定量检测腹泻性贝类毒素的荧光磷酸酶抑制检验方法。本部分适用于双壳类贝肉、贝柱中的大田软海绵酸及其衍生物的检验。2缩略语下列缩略语适用于SN/T2131的本部分。2. 1DSP diarrheic shellfish poison toxin腹泻性贝类毒素。2. 2OA Okadaic acid大田软海绵酸。2. 3DTXs大田软海绵酸族衍生物。3样品保存与制备3.1样品的保存如实验室不能立即检验，应分别用标签注明来源、取样日期、品种及编号，装塑料袋密封。抽样后样品应立即于一18℃以下冷冻保存。3.2样品的制备用清水彻底洗净待检贝壳，打开贝壳，彻底清洗贝壳内部，除去内部污质，取出所有贝肉组织，用滤纸尽量吸干贝肉组织的多余水分，待检贝肉组织不得少于50g。4　测定方法4.1方法提要本方法的测定原理是大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)及其衍生物(DTXsr的毒性与它们抑制丝氨酸和苏氨酸磷酸酶蛋白的活性直接相关，特别是 PP1和 PP2A两种蛋白;在磷酸酶及其荧光酶作用物的微孔板实验中，大田软海绵酸及其衍生物的浓度直接决定了磷酸酶水解荧光酶作用物的能力，水解后荧光酶作用物产生荧光，然后通过荧光标仪读取荧光值，样品中毒素的浓度可以通过标准曲线计算得出。4.2试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯,水为去离子水。4.2.1100%（体积分数）甲醇mol/L的氢氧化钠溶液：100g氢氧化钠溶解于 500 mL水中,定容至1000mL。 mol/L的盐酸溶液：205 mL浓度为 37%（体积分数）的盐酸加人400 mL水中，定容1 SN/T 2131. 1--2008至1 000 mL。4.2.496孔微孔板(12×8)。4.2.5磷酸酶溶液:见附录 A第 A.1章。4.2.6大田软海绵酸标准品:0 nmol/L,0.5 nmol/L,1 nmol/L,1.5nmol/L,2nmol/L和 3 nmol/L。4.2.7 荧光酶作用物:见附录 A第 A.2 章。4.2.8磷酸酶稀释缓冲溶液。4.2.910 mmol/L的三（羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(Tris-HCl)：见附录 A第 A.3章。4.3仪器和设备微量移液器：100 μL或者200 μL可调移液器，以及1000 μL可调移液器。4.3. 14.3.2旋涡混匀器。4.3.3培养箱或者加热块：37℃2~℃荧光酶标仪：360nm±15hm激发波长，455nm±20nm发射波长。.5水浴锅：76℃±2℃。4.3.6分析天平：0.01g感量。冰箱:2℃～8℃和-15℃～—20℃.8²灭菌玻璃器具：20mL和250mL的量筒，1000mL容量瓶。4.3.950mL带螺旋盖离心管。4. 4测定步骤以下过程不可以使用微孔板振荡器。4.4.1提取：捣碎贝肉组织，称取5g到50mL离心管，加25mL浓度100%的甲醇，用旋涡均质2min，在4℃下离心10 min(2000°r/min），上清液（甲醇萃取液)倒人新离心管。4.4.2水解：取0.640 μL的上清液（甲醇萃取液)到另二个离心管,加100 μL的2.5mol/L的氢氧化钠，密封后在76℃±2℃中加热40mfn,再加80μL的2.5mol/L的盐酸，然后加浓度为10mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(4.2.9)直到为20 mL,待检。4.4.3加样：准备好所需要的96乳微孔板（4.2.j4），建议样品和标准品都做2个～3个平行，旋涡均质标准品后，取制备好的待检样及标准品各50μL分别加入相应的检测小孔；立即添加70μL的磷酸酶溶液(4.2.5)到每个小孔；用粘胶纸密封，轻微振荡混合。4.4