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TUNEL 检测方法 检测原理： ——DeadEnd??Colorimetric?TUNEL System 试剂盒法 细胞凋亡时，其 DNA 会产生 3′-OH 末端，而正常细胞则几乎没有。使用末端脱氧核苷转移酶(TdT 酶)将生物素标记的核苷酸连接到 DNA 的 3′-OH 末端。再将辣根过 氧 化 物 酶 标 记 的 链 霉 亲 和 素 (Streptavidin?HRP) 结 合 在 此 核 苷 酸 上 。Streptavidin?HRP 可与过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)产生深棕色反应。即可通过光学显微镜观察到凋亡细胞。 材料 名称量 名称 量 说明 平衡缓冲液 9.6ml 生物素标记的核苷酸混合 40μl 2 × 20μl 物 TdT 酶 40μl 2 × 20μl Streptavidin?HRP 40μl 0.5mg/ml DAB 20X Chromogen 200μl DAB Substrate 20X Buffer 200μl Hydrogen Peroxide 20X 200μl SSC, 20X 70ml Proteinase K 10mg Plastic Coverslips 储存条件:? 40 (2 × 20) 平衡缓冲液,?TdT 酶,?生物素标记的核苷酸混合物，蛋白酶 K?：–20°C Streptavidin?HRP,?DAB?20X?Chromogen,?20X?DAB 底物缓冲液，20X 过氧化氢：?4° C 20X?SSC，塑料盖玻片：室温保存 需自备： PBS?缓冲液 0.3%过氧化氢溶液（用以抑制内源性过氧化氢酶?） 固定液（例如：10%缓冲的福尔马林，4%多聚甲醛，4%无甲醇甲醛）? 封固剂 用于组织的检测方法 由试剂盒内容制备： 20μg/ml 蛋白酶 K 工作液： 10mg 蛋白酶K＋1ml 蛋白酶K 缓冲液r→10mg/ml 蛋白酶K 储备液→ 20μg/ml 蛋白酶K 工作液 TdT 酶反应液（使用时制备）： 缓冲液成分 缓冲液成分 每 标 准 反应次数（实验 成分的体 100ul 反 应 反应+ 选择性阳 积 的成分体积 性对照） 平衡缓冲液 98ul ×? = 生物素化的核苷混 1ul × = 合物 rTdT 酶 1ul? ×? =? 2X SSC： 用去离子水 1：10 稀释 20X?SSC Streptavidin?HRP 工作液： 以 PBS500：1 稀释 Streptavidin?HRP. DAB 混合液（使用时制备，避光，30mins ）： 950ul 去离子水＋50ul?20X?DAB 底物缓冲液＋50ul?DAB?20X?色原体＋50ul?20X 过氧化氢 步骤： 0.85%氯化钠溶液浸洗 5mins（室温） PBS 浸洗 5mins（室温） 4%多聚甲醛溶液或含 10%福尔马林的 PBS 溶液中固定 15?mins（室温） PBS 浸洗二次，每次 5?mins（室温） 除去多余液体，滴加 100μL 20μg/ml 蛋白酶 K 工作液，覆盖组织。置于平面，孵育 10--30mins（室温）。 染色缸内 PBS 浸洗 5mins。（室温） 4%多聚甲醛溶液或含 10%福尔马林的 PBS 溶液固定 5?mins。（室温） PBS 浸洗二次，每次 5?mins。（室温） 除去多余液体，滴加 100μL 平衡缓冲液，覆盖组织。置于平面，平衡5～10mins （室温）。 置于冰上，除去多余液体，添加 100μLTdT 酶反应液，防止干燥。37℃，湿盒中孵育 60min，（以使末端标记反应发生）。（过程中应防止干燥）。 染色缸内 2X SSC 浸洗 15mins（用于终止反应）。（室温） PBS 浸洗三次，每次 5min，（用于移去未结合的生物素标记的核苷酸）。（室温） 0.3%过氧化氢的 PBS 中浸洗 3-5min（用以抑制内源性过氧化氢酶）。（室温） PBS 浸洗三次，每次 5min。（室温） 加 100μLStreptavidin?HRP 工作液，反应 30min。（室温） PBS 浸洗三次，每次 5min。（室温） 加 100μL?DAB 混合液，直到呈现浅棕色背景，但背景不可太深。 去离子水漂洗若干次。 用水或永久的封片剂封片，水封片剂周围用指甲膏封住，显微镜下观察染色。 用于细胞的检测方法 需自备： Poly-L-Lysine 覆盖的切片： 在干净的载玻片表面铺 poly-L-lysine（可以 Sigma Cat.# P 892010 倍稀释于水制得），在所需区域铺一薄层。待干后，迅速以去离子水冲洗，空气干燥 30--60mins。4℃可储存 7 天。 0.2% Triton X-100 溶液： Triton X-