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常用有机溶剂对细菌活性的影响 目前，正确的药物敏感测试是评估药物抗菌效果的最方便、最常用的细菌耐药性测定方法。由于其良好的重复性和高重复性，一般用于药物的初始筛选，以及对抗菌药物临床疗效的监测和对细菌耐药性的检测。 1 材料和方法 1.1 实验试剂及仪器 实验室所用的E.coli和S.aureus由锦州医科大学附属第一医院检验科提供,经驯化后以25%甘油冷冻保存,使用前解冻。 注射用头孢曲松钠(批号313121017),山东罗欣药业集团股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯及常见生化试剂,实验用水为去离子水。 721型可见分光光度计,上海欣茂仪器有限公司;SYQ-DSX-280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械有限公司;SW-CJ-1E洁净工作台100级,上海博迅实业有限公司;KYC-100B孵育箱,上海福马实验设备有限公司。 1.2 麦氏比浊管的制备 Luria-Bertani(LB)培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,Na Cl 10.0,用0.1 mol/L Na OH调节p H至7.4±0.2,1×10 Mueller-Hinton(MH)培养基(g/L):牛肉浸粉2.0,可溶性淀粉1.5,酸水解酪蛋白17.5,用0.1 mol/L Na OH调p H至7.4±0.2,1×10 0.5麦氏比浊管配制方法:将1.17%Ba Cl 1.3 生长溶剂对e.coli活性测定的影响 取10μL大肠杆菌甘油溶液于5 m L肉汤培养基中活化4 h,用MH培养基稀释至0.5麦氏比浊标准待用。取无菌比浊管10支,采用倍比稀释法调节每支比浊管内菌浓度并加入乙醇,使乙醇的终浓度(体积比)分别为32%、16%、8%、4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%,第10支管为对照管,以蒸馏水代替乙醇。在37°C、120 r/min培育20 h后取样,以MH培养基为空白参比,于600 nm下测定样品吸光度,根据公式(1)计算抑菌率,估计乙醇对E.coli活性的影响,药用溶剂丙酮和DMSO对E.coli活性的影响检测方法同乙醇。 溶剂对细菌活性的影响用抑菌率I(%)表示: 其中:I代表药用溶剂对某菌株的抑菌率;A 以肉汤稀释法分别测定DMSO、乙醇和丙酮对S.aureus活性影响的实验步骤同E.coli活性检测方法。 超微结构的观察:以E.coli为代表,取活化后的菌样制备成0.5麦氏比浊标准的菌悬液,以终浓度分别为8%和32%丙酮-菌悬液为实验组,不含丙酮的菌悬液作为对照组,37°C、120 r/min孵育20 h后,按照电镜样品制备方法制备样品,送渤海大学分析实验室扫描电镜,观察菌体形态变化,以此说明溶剂对E.coli形态的影响。 1.4 e.coli和s.aureus,分离培养平板的制备和抑菌圈直径测定 含不同浓度乙醇、丙酮、DMSO纸片的制备:取直径为5 mm的滤纸片若干,灭菌后烘干。以灭菌蒸馏水将3种溶剂分别稀释成终浓度(体积比)为32%、16%、8%、4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%的溶液,取不同浓度的上述溶液10μL滴在滤纸片上待用(乙醇、丙酮易挥发,现用现制);配制阳性对照品:取10μL 3 g/L注射用头孢曲松钠贮备液,滴在滤纸片上待用。用无菌棉签蘸取稀释至0.5麦氏比浊标准的E.coli或S.aureus,分别均匀涂布于MH固体培养基的平板上,稍干,用无菌镊子取不同浓度(32%、16%、8%、4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%)药用溶剂(乙醇、丙酮、DMSO)滤纸片,贴在已接种细菌的MH固体培养基平板表面。同时将头孢曲松钠纸片(3 g/L)作为阳性对照,以无菌蒸馏水纸片作为阴性对照。将平板底部朝上放于37°C孵育箱中,培养20 h观察抑菌环直径大小,用以评价不同浓度的3种溶剂对E.coli和S.aureus的抑制作用。不同抗菌药物对不同菌株产生的抑菌环直径不同,每个菌株产生抑菌圈直径与敏感度关系的标准也不尽相同,一般认为抑菌环直径15 mm为高度敏感;10 mm-15 mm为中度敏感;10 mm为低度敏感;无抑菌环则为耐药 1.5 dmso最佳添加量的确定 E.coli菌液制备:取3-5个E.coli菌落接种于5 m L LB培养基中,培养4 h,待用。分别加入100 m L LB培养基的锥形瓶编为0-11号,向1-11号瓶加入DMSO,使其终浓度(体积比)分别为0、0.25%、0.5%、1%、4%、5%、8%、10%、12%、16%、32%。除0号瓶空白对照不接种菌液,其余各瓶分别接种50μL E.coli菌液,置于37°C培养。分别于0、2、4、8、10、12、14、18、20、24、26、32 h取样测定OD 生长曲线法测定3种溶剂对S.aureu