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不同性别和生长阶段对克氏原螯虾肠道菌群的影响 肠微生物生活在动物肠道粘膜和分泌物中。在长期进化过程中，它与主人和主人有着极其密切的关系。在正常生理状态下,肠道微生物之间通过相互作用维持着动态平衡,共同影响宿主的营养、免疫、生产性能、生理状态和疾病等过程 影响肠道菌群稳态的因素有很多,例如宿主基因型、性别、环境、生长阶段和食物等。这在哺乳动物中已有广泛研究,在鱼类中的研究也有较多报道 克氏原螯虾是一种淡水虾类,是我国重要的经济养殖虾类之一 1 材料和方法 1.1 不同性别克氏原螯虾肠道取样 克氏原螯虾样品采集自湖北省武汉市蔡甸区武汉沃土清源稻虾供养专业合作社(30.39°N,113.77°E)。取不同性别,体长约10.00 cm的克氏原螯虾成虾,用75.0%的酒精进行体表消毒,在无菌环境下分离其后肠,每3—4只虾肠混成一个样品,保证每个样品肠道中的内容物共计不低于0.20 g,其中雌性3个样品,雄性4个样品,置于无菌管中,在-80℃下冻存。对克氏原螯虾的处理严格遵从实验动物饲养和处理标准。用粪便基因组DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取样品微生物总DNA。 1.2 亲虾与苗种的饲养 克氏原螯虾亲本采集自武汉沃土清源稻虾供养专业合作社。体表用高锰酸钾浸泡消毒后,置于经高锰酸钾消毒过的水族箱中暂养2周,养殖密度为10只/箱,雌雄性别比例为1:1。养殖用水为经过曝气的自来水,水深(5.00±1.00) cm,水温(25.00±1.00)℃,L:D为12:12,投喂商业颗粒饲料(通威集团生产)。亲虾自然交配产卵,幼虾孵出后置于另外的水族箱中饲养,投喂饲料和饲养条件与成虾相同。取体长约2.00 cm的幼虾(孵化后1个月)肠道(10只幼虾肠道混为1个样品)及体长约27.00 cm的成虾(3只成虾肠道混为1个样品),置于无菌管中,在–80℃下冻存。按1.1的方法提取总DNA。 1.3 pcr和aaxprepna凝胶的制备 对16S rRNA的V3—V4区域进行扩增(引物为341F:5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R:5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。热反应条件为94.00℃变性5min;94.00℃30s,54.00℃30s,72.00℃30s的30个循环;最后在72.00℃下延长10min。从1.2%琼脂糖凝胶上切下PCR产物,并使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(AXYGEN,美国)纯化。对每种纯化的PCR产物进行基于Illumina的高通量测序(BGI,中国深圳)。 1.4 物种多样性分析 对数据进行数据过滤 Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析 Beta多样性分析是用来比较一对样品在物种多样性方面存在的差异大小,包括Bray-Curtis距离、weighted UniFrac距离和unweighted UniFrac距离等。通过QIIME (v1.80)软件分析各类群在样品中的含量,进而计算出不同样品间的Beta多样性值。 2 结果 2.1 肠道菌群的形成和分类 高通量测序的一般分析对2组克氏原螯虾样品(4个雄性样本,3个雌性样本)的肠道微生物进行测序,去除低质量序列后,共获得876639条序列,雄性肠道菌群高质量序列在122100—133200,雌性高质量序列在123068—127654。对每个样本获得的序列按97.0%的序列相似度进行归并和OTU划分,共得到2039个OTU。 用Alpha多样性指数分析雌雄虾肠道菌群多样性的差异(表1)。Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数均无显著性差异,表明雌雄克氏原螯虾肠道菌群的Alpha多样性在统计学上无差异。 肠道菌群组成和结构通过与数据库进行比对,对OTU进行物种分类并分别在门、纲、目、科、属、种几个分类等级对各个样品作物种profiling面积图和柱状图。在门水平上,雌雄克氏原螯虾肠道优势菌群(相对丰度1.0%)组成较为一致,包括变形菌门Proteobacteria (27.3±12.8)%、厚壁菌门Firmicutes (25.7±14.1)%、软壁菌门Tenericutes(18.8±13.7)%和拟杆菌门Bacteroidetes (18.3±17.3)%等,各优势菌门在个体间丰度不同,但不具有显著性差异(图1)。 在属水平上,除未能归类的属外,雌雄克氏原螯虾肠道优势菌群的组成较为一致,包括拟杆菌属Bacteroides (11.8±14.0)%、希瓦氏菌属Shewanella(6.8±6.5)%、梭菌属Clostridium (4.8±7.7)%、厌氧杆菌属Anaerorhabdus (3.8±5.3)%和柠檬酸杆菌属Citrobacter (1.5±0.7)%等,个体