SN 1315-2003牛地方流行性白血病琼脂免疫扩散试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1315—2003牛地方流行性自血病琼脂免疫扩散试验操作规程Protocol of agar gel immunodiffusion testfor enzootic bovine leukosis2004-02-01实施2003-08-18发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1315—2003前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈世松、崔向东、赵增连。本标准系首次发布的检验检疫行业标准I SN/T 1315—2003牛地方流行性白血病琼脂免疫扩散试验操作规程1 范围本标推规定了牛地方流行性白血病琼脂免疫扩散试验操作规程。本标准适用于牛地方流行性白血病病毒抗体的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本标准。3. 1AGID Test琼脂免疫扩散试验。3.2EBL牛地方流行性白血病。4原理抗原及特异性抗体在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受阻力很小，基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子的相对分子质量、结构、形状和电荷量不同，因此扩散系数不同，在凝胶中的扩散速度就不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而形成沉淀，呈现出线状，称为免疫沉淀线或免疫沉淀带。AGID Test即根据抗原与阳性血清之间出现的沉淀线来判定被检血清中是否存在特异性抗体。5试剂和器材5.1抗原由感染 EBL病毒的胎羊肾细胞(FLK)培养液经提取和浓缩制成，是以病毒囊膜糖蛋白（gp)为主并含髓核蛋白（p)的混合抗原，病毒囊膜糖蛋白滴度不得低于四个单位，试验时与标阳性清之间必须在24h内出现清晰的沉淀线，与标准阴性血清之间不得出现任何沉淀线。本抗原以冻干产品供应，用时以水溶解，并恢复到原体积。5.2标准阳性血清能与标准抗原在24h 内产生明显的细直而致密的一条沉淀线（gp抗体），末端接触二侧相邻孔的边缘。1 SN/T 1315—-20035.3被检血清按常规方法采血分离血清,在4℃保存。5.4琼脂糖平板的制备5.4.1琼脂糖凝胶的配方1.0g琼脂糖(试剂级)8.5g氯化钠(试剂级）1.0 mL1.0%硫柳汞（试剂级）99.0 mL(见附录 A)磷酸盐缓冲液(0.05mol/LpH7.2)试验用蒸馏水为GB/T 6682一1992中的二级水。5.4.2平板制作将充分融化的琼脂糖凝胶15 mL～17mL在 50℃～60℃时加到平血(直径 9 cm)中,注意不要产生气泡,凝胶板厚度为 2 mm，凝固后把平Ⅲ倒置,在 4℃冰箱中可保存10 d。5.5器材直径9cm平皿;-0 μL~50 μL、0 μL~100 μL微量加样器;-0 uL～100 μL 微量滴头;-200mL三角瓶；-内径5 mm打孔器。6操作方法6.1琼脂糖平板打孔6.1.1孔型图案的准备：在坐标纸上画好七孔型或63孔型图案（见图1和图2)供选用,孔径5mm，孔距3mm。6.1.2把图案放在平皿下，用打孔器按图型推确位置打空。孔内琼脂用针头小心挑出或者用真空吸出，勿破坏周围琼脂。若琼脂与平皿底部结合有松动，用酒精灯火焰轻轻加热平皿底部使琼脂与平皿底部结合紧密。6.2滴加抗原和血清6.2.1七孔型（见图1所示），中央孔加抗原（G）,1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔分别加三份被检血清。 SN/T 1315---2003图 1 琼脂糖平板打孔 7 孔型图案6.2.263孔型（见图2所示），按图孔G”加抗原。“”孔加标准阳性血清，数字孔加被检血清（同时可检查40份样品）。各孔一次加满，但不溢出，平血加盖后放在湿盒中，于室温（20℃以上）作用，24h和48h各检查一次，检查时用斜射强光，背景要暗。00OOO④O?④O+GO0O??15(1614(17)(8(19)+G(+)G)27333430313229)+G+G+GT3536)2琼脂糖平板打孔63孔型图案 SN/T 1315—20037 结果判定7. 1阳性判定根据被检血清中抗体种类和浓度的差别可能出现下列几种结果：7. 1.1 阳性出现一条清晰沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端完全融合。少数被检血清在此沉淀线的