NY_T 2549-2014饲料中黄曲霉毒素B1的测定 免疫亲和荧光光度法.pdf

ICS 65.120B 25NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2549—2014饲料中黄曲霉毒素B的测定免疫亲和荧光光度法Determination of aflatoxin B, in feed-Immunoaffinity fluorescencemethod2014-03-24 发布2014-06-01实施中华人民共和国农业部S发布 NY/T2549—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业部油料及制品质量监督检验测试中心本标准主要起草人：李培武、张文、胡小风、丁小霞、张奇、周海燕、陈小媚、唐晓倩、张兆威、王督。I NY/T2549—2014饲料中黄曲霉毒素B1的测定免疫亲和荧光光度法1范围本标准规定了免疫亲和荧光光度法测定饲料中黄曲霉毒素B，的方法。本标准适用于饲料及饲料原料中黄曲霉毒素B，的测定本标准黄曲霉毒素B检出限为0.3ug/kg2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中黄曲霉毒素B与免疫亲和柱中固定相上抗体发生特异性结合·其他与抗体不发生免疫亲和反应的成分随流动相流出，利用甲醇使固定相上抗体变性，将固定相上抗体结合的黄曲霉毒素B，洗脱，荧光定量检测。4试剂除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.1水，按照GB/T6682中的要求，二级4.2氯化汞（HgCl.）。4.3硫酸奎宁（CHzN（),S)。4.4甲醇(CH()H)。4.5浓硫酸（HS(),）。4.670%甲醇溶液：取70ml甲醇（4.4）.加30ml.水（4.1），混匀。4.7黄曲霉毒素B荧光增强剂：准确称取2.72g氯化汞（4.2），溶于水中，定容至1.0I。4.81000ng/mlL黄曲霉毒素B:标准溶液。4.9100ng/ml黄曲霉毒素B，标准储备液：准确吸取黄曲霉毒素标准溶液（4.8）1ml.于10ml容量瓶中，加甲醇定容。4℃可保存3个月。警告：由于黄曲霉毒素毒性很强-试验人员应注意自我保护。操作时.应避免吸人、接触黄曲霉毒素标准溶液。标准溶液配置应在通风橱内进行.工作时应戴眼镜、穿工作服、戴医用乳胶手套。凡接触黄曲霉毒素的容器.需浸人10%次氯酸钠溶液12h以上。同时.为了降低接触黄曲霉毒素的机会·本标准鼓励直接购买并使用黄曲霉毒素的有证标准储备液。4.10黄曲霉毒素B标准工作液：分别准确吸取黄曲霉毒素B标准储备液（4.9)0.00mlL、0.01mL、0.05ml、0.25mlL、0.50ml、1.00ml、3.00ml于10ml.容量瓶中，甲醇定容，分别相当于0.0ng/ml.、0.1ng/ml.、0.5ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml.、30.0ng/ml浓度标准工作溶液4.11黄曲霉毒素B免疫亲和微柱：柱容量≥30ng：AFB免疫亲和柱与其他种类黄曲霉毒素的交叉反应率均≤10%。1 NY/T 2549—20145仪器设备5.1黄曲霉毒素荧光速测仪或荧光光度计：能在激发波长为（360土5）nm.检测波长为（440士5）nm条件下测定。5.2分析天平：感量0.1g。5.3均质机：转速大于等于20000r/min。5.4漩涡混合器。5.5恒温装置：（37.0±2.0)℃。5.6微量移液器：10μl~100μL,100μl~1000μl。5.7中速定性滤纸。5.8玻璃纤维滤纸。5.9泵流操作架或固相萃取装置。5.10分样筛：20目。6分析步骤6.1试样制备样品粉碎至全部通过分样筛（5.10），充分混合。6.2提取准确称取25.0g试样于烧杯中，加人100.0ml甲醇溶液（4.6），用均质机（5.3）20000r/min提取2min后.静置1min.中速定性滤纸（5.7）过滤。取10mL滤液，用20mL水稀释，漩涡混合器（5.4）混匀.经玻璃纤维滤纸（5.8）过滤，备用。6.3纯化将黄曲霉毒素B，免疫亲和微柱（4.11）与泵流操作架或固相萃取装置（5.9）连接，加人10.0ml.纯水平衡微柱.当微柱中仅余少量液体时，加入10.0ml.稀释后的提取液（6.2），流速为1.5mlL/min通过微柱；取10.0ml.水分两次淋洗微柱中液体被抽干时，停止抽滤，弃去全部流出液。加1.0ml.甲醇（4.4）于微柱中.流速为1mL/min，抽滤至微柱中液体全部流出，收集全部洗脱液于比色杯（光径为1cm），加入1.0ml.纯水，混匀待测。6.4标准曲线将配制好的黄曲霉毒素B的标准工作液（4.10），在黄曲霉毒素荧光速测仪或荧光光度