SN 1678-2005梨形虫病病原鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1678--2005梨形虫病病原鉴定方法Protocol of agent identification for piroplasmosis2005-09-30发布2006-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1678—2005前言本标准参考了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》2004版的2.3.8,2.3.9和2.5.6章。本标准的附录 A 为规范性附录,附录 B、附录 C、附录 D、附录 E为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：高志强、张鹤晓、谷强、郭晋优。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1678—2005梨形虫病病原鉴定方法范围本标准规定了牛、羊、马及犬的梨形虫病病原鉴定方法。本标准适用于牛、羊、马及犬的梨形虫病病原检测与鉴定。2器械与试剂2. 1 试剂-EDTA溶液(1 mg/mL）（见附录 A);-5%与10%的姬姆萨染液（见附录A);甲醇（分析纯）。2.2器械光学显微镜（8倍以上目镜和60倍以上物镜）；目镜测微计；镜台测微计；一5mL注射器,20号针头，一载玻片。3样品的采集3.1活动物：从尾尖或耳尖部采血，制作血涂片；也可无菌采集颈静脉血于抗凝剂EDTA溶液中(1 mg/mL)。3.2病死动物：采样时死亡时间不超过24 h，采集样品包括来自蹄冠、耳朵及尾尖的外周血以及大脑皮层、肾、肝和骨髓等脏器（按重要性排序）。采集的样品于低温条件下(5℃左右)迅速送达实验室。3.3泰勒虫病采样:除采血外,还需穿刺淋巴结进行涂片。4操作方法4.1涂片制作及固定4.1.1薄血膜的制作在洁净玻片近左端滴1滴血液，用推片沾取少量血液，从载片近右端处涂一薄的血膜,空气干燥后，用甲醇固定1 min,再用10%姬姆萨染液染色 20 min～~30 min,刚涂好的血片应尽快染色，以确保良好的染色质量。4. 1. 2厚血膜的制作于洁净的载玻片上滴1小滴血液（约50μL），风干后80℃加热固定5min然后用5%姬姆萨染液染色 20 min～30 min。4. 1.3脏器涂片的制作用1块洁净的玻片轻触脏器的新鲜切面，或者以2块洁净的玻片轻轻夹住1小块组织，纵向推压玻片，使两玻片都留下1层组织。待涂片风干后，用甲醇固定·5min，再用10%姬姆萨染液染色20 min～30 min.4.1.4淋巴液涂片的制作将用注射器抽取的淋巴液推至载玻片上，再用针头抹开，制戒涂片。待涂片风干后，用甲醇固定1 SN/T 1678--20055 min，再用10%姬姆萨染液染色20 min～30 min。4.1.5血液浓集检查取一离心管,加人抗凝血 6 mL～7 mL,充分混合，500 r/min 离心5 min。用吸管吸取接近红细胞层的黄色血浆2mL～3mL到另一个离心管中，以2000 r/min 的速度离心40 min,弃去上层液体，用沉淀制各涂片，风干后80℃加热固定5min，然后用5%姬姆萨染液染色20min～30min。4.2涂片虫体大小的显微测量使用目镜测微计和镜台测微计进行虫体大小的显微测量。4.3染色涂片虫体的镜检用8倍以上目镜和60倍以上物镜,在油浸下检查染色涂片。先用低倍镜对血膜整体观察下，梨形虫具有明晰而纤细的轮廓，有淡蓝色的浆和红紫色的染色质。镜检时，观察一个红细胞内的虫数，虫体在红细胞内的位置，虫体的大小、形态、染色质块的数目，同时观察红细胞染虫率的高低。至少观察100个视野。5 判定5.1牛、羊及犬巴贝斯虫5.1.1感染牛的巴贝斯虫:形态图参见第C.1章。 牛巴贝斯虫：该虫虫体较小,通常位于红细胞中央，长约1 μm～1.5 μm,宽0.5 um～1.0 um，虫体成对出现，且一端相连成钝角。分歧巴贝斯虫：虫体也较小，在形态上与牛巴贝斯虫非常类似，所不同的是成钝角相连的成对虫体常位于红细胞边缘。双芽巴贝斯虫：虫体较长，长约3μm～3.5 μm,宽1 μm～1.5μm,成对虫体往往呈锐角相连各有2个不相连的红染点(而牛巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫往往只有1个红染点）。卵形巴贝斯虫为大型虫体。虫体成典型的梨形，但也有形状各异的单个虫体存在。5.1.2感染羊的巴贝斯虫：形态图参见第C.2章。感染羊的巴贝斯虫主要为莫氏巴贝斯虫，该虫为大型虫体，虫体呈圆形或梨形。5.1.3感染犬的巴贝斯虫：形态图参见第C.3章。犬的吉氏巴贝斯虫虫体很小,长度一般为 1 μm～2.5 μm，多位于红细胞边缘或偏中央，呈梨形、环形、椭圆形、圆形、小杆形等多种形态。5.2牛、羊泰勒虫形态图参见附录D,裂殖体的形状与大小不一，着染成浅蓝色或蓝色，其中含有浅红色或深紫色的染色质核，裂殖