利用死谷芽孢杆菌防治木霉的研究.docxVIP

利用死谷芽孢杆菌防治木霉的研究 在蘑菇的生产和应用中，从栽培、细菌感染和蘑菇生产的各个阶段，都会感染不同的细菌。例如，蘑菇被木霉（tichoidma）感染，细菌的茎和茎变黄褐色，细菌的盖变腐败。在后期，感染的种子逐渐腐烂，所有细菌棍子都腐烂了。木霉具有很强的腐生竞争能力,与香菇接触共同培养时发现,两菌丝互相缠绕,与香菇竞争养分,导致香菇菌丝出现枯萎、溶解,不能正常生长。吴小平等对食用菌栽培过程中相关木霉种做了形态学和ITS鉴定发现侵染食用菌栽培料中哈茨木霉(T.harzianum和长枝木霉(T.longibrachiatum)出现频率最高。为了减少杂菌的侵染,农业上化学药剂多使用甲醛溶液、多菌灵、克霉灵、百菌清等进行杀灭。长久施用化学药剂,使得杂菌产生了耐药性,甚至突变株,田连生等在耐药性木霉菌株的诱变选育过程中,得到一株能矿化多菌灵的变异菌株T32,具有很强的耐药性。化学药剂虽然可以杀灭食用菌生产过程中侵染的部分杂菌,但是农药残留一直是影响食用菌品质的重要问题。 芽孢杆菌(Bacillus sp.)是人类发现最早的细菌之一,分布广泛,其抑制病原菌的范围很广、抗性强、无毒副作用,在动植物的生物防治中应用比较广泛。芽孢杆菌可产生肽类、脂肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类等抗菌物质不同种类的抗菌物质有不同的生物学活性,因此芽孢杆菌所分泌的胞外抗菌物质能抑制真菌、细菌、病毒等多种致病因子。芽孢杆菌作为生防菌的研究,多数应用集中于防治动植物病原菌引起的病害,并有大量的报道。而死谷芽孢杆菌经过鉴定,与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)类似,可以对链球菌(Streptococcus mutans)产生抑制作用。微生物制剂在食用菌栽培中的成功应用目前还很少,生物防治尚处于起步阶段,为此本文针对香菇生产栽培过程中出现的木霉菌,进行了生物防治方面的相关研究,将有助于降低食用菌生料栽培出现的杂菌侵染。 1 材料和方法 1.1 培养基和材料 菌株B10:死谷芽孢杆菌Bacillus vallismortis。 木霉(Trichoderma sp.)29、74(保藏中心编号3.3029,3.2774),香菇(Lentinus edodes)P18,辽宁省微生物科学研究院菌种保藏中心提供。 培养基:NA培养基,LB培养基,PDA培养基。 香菇栽培料:木屑78%,麸皮20%,石膏1%,糖1%。180 mm试管中装入栽培料干料6 g,水5 m L,1uf0b4105Pa灭菌2 h。 1.2 发酵液的制备 菌株B10在NA斜面上活化24 h后,于100 mL LB液体培养基中培养,170 r/min、32°C±1°C培养24 h作为种子液,吸取5 mL于95 mL LB培养基中再振荡培养36 h得到B10的发酵液。 参照文献的方法,略作改动,将36 h发酵液装入50 mL离心管,4°C、8 000 r/min离心10 min,将上清液过0.22μm微孔滤膜得到发酵上清液。用6 mol/L盐酸调p H至2.0,4°C过夜。4°C、10 000 r/min离心10 min,弃上清,沉淀调p H至7.0,80%甲醇抽提2次,40°C真空干燥,得红棕色固体即为脂肽粗提物。用无菌水或80%甲醇重新溶解,配置成0.1 g/L准备待用。 1.3 l脂肽粗提物溶液的配制 将平板培养的木霉用8 mm打孔器打孔制成菌碟,接入新的PDA培养基平板一侧,另一侧加入牛津杯,相距30 mm,加入200μL脂肽粗提物溶液,以无菌水和80%甲醇溶液为对照,3次重复。26°C±1°C培养48 h,测量抑菌圈大小。 抑菌带宽按照下式计算: 脂肽粗提物用无菌水配制成0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0 g/L,用滤纸片法,蘸取溶液,放入PDA培养基中,接入木霉于PDA培养基中间,每处理3次重复,26°C±1°C培养48 h后观察抑菌圈,计算最小抑制浓度。 1.4 木霉t-gfp制备木霉的制备 将50μL脂肽粗提物水溶液与100μL PDA液体培养基混匀,加入表面皿,以加入50μL无菌水为对照,用1 mL无菌水洗下木霉的孢子,制成悬液,调整浓度为6×107CFU/m L,向表面皿内加入50μL,每个处理3次重复,置于26°C±1°C恒温培养8 h后,每4 h镜检一次,计算孢子萌发率。 1.5 关于脂肪醇稳定性的研究 1.5.1 木霉对pda的活性 脂肽粗提物水溶液经20°C、40°C、60°C、80°C、100°C和121°C分别处理10 min后,用滤纸片法,蘸取处理过的溶液,放入PDA培养基中,接入木霉于PDA培养基中,每处理3次重复,26°C±1°C培养48 h后观察抑菌活性。 1.5.3 紫外灯时间对抑菌活性的影响 取100μL脂肽粗提物水溶