再生障碍性贫血患者h1、h2细胞的功能状态及其与造血衰竭的关系.docxVIP

再生障碍性贫血患者h1、h2细胞的功能状态及其与造血衰竭的关系 根据大量临床和实验研究，t淋巴细胞异常免疫对促进或消除贫困（再障碍）的发生和发展起着重要作用。患者外周血和骨髓T淋巴细胞被异常激活,产生可溶性的细胞因子,如IFN-γ抑制造血。细胞因子调节的中心是CD4+T淋巴细胞,即辅助性T淋巴细胞(Th),为了解Th细胞在再障发生和发展中所起的作用,我们对再障患者的骨髓单个核细胞(BMMNC)及外周血单个核细胞(PBMNC)的Th细胞各亚型的数量、比例、产生细胞因子的功能状态及其与造血衰竭的关系进行了研究。 病例和方法 1 全国再障诊断标准 32例再障患者,中位年龄38岁(17～60岁)。其中男18例,女14例,重型再障(SAA)21例,慢性再障(CAA)11例。所有病例均为1999年3月～2001年1月我院收治的初治病例,诊断均符合全国再障诊断标准。病例对照组为26例非再障的血液系统疾病所导致全血细胞减少或贫血和(或)血小板减少患者,男12例,女14例。其中阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者6例、骨髓增生异常综合征(MDS) 患者6例, 急性白血病(AL)患者5例,BMMNC-Coombs试验阳性的免疫相关性全血细胞减少症(IRP)患者9例。诊断均符合文献标准。11名正常志愿献髓者作为正常骨髓对照,其中男5名,女6名,中位年龄29岁(21～37岁)。17名正常志愿献血者作为正常外周血对照。其中男15名,女12名。中位年龄31岁(19～43岁)。 2 耐药因子及血清因子 细胞培养试剂及细胞体外刺激和抑制剂均购自美国Sigma公司;单克隆抗体鼠抗人CD4-FITC、IFN-γ-PE、IL-4-PE及阴性对照均购自美国BD公司; TRIzol、逆转录酶(M-MLV)购自美国Gibco公司;引物为上海生工生物工程公司合成,其它相关试剂分别购自上海生工生物工程公司。 3 bmmna的培养和1-tot-trizel-4-pe 无菌抽取确诊后治疗前再障患者骨髓7～8 ml;外周血10～12 ml,非再障患者及健康志愿者骨髓各4～5 ml,健康志愿者外周血5～6 ml,肝素抗凝,以IMDM培养液适当稀释后,淋巴细胞分离液分离MNC(1 800 r/min, 20 min), 用IMDM培养液洗3次后计数,分别用于如下试验:①免疫粘附法去除CD4阳性T细胞, 采用甲基纤维素半固体培养方法作祖细胞培养,扩增CFU-E、CFU-GM及BFU-E。以IMDM为基本培养基,2×105/ml BMMNC 的细胞浓度,接种于24孔板,每孔0.5 ml, 平行接种3孔,放置于37 ℃、体积分数为5%的CO2、95%湿度孵箱内培养。分别计数CFU-E、CFU-G (第7天)和BFU-E(第14天)。②收获PBMNC,用IMDM培养液洗2次后,按5×105/ml细胞的浓度培养于以IMDM为基本培养基的混合液中(内含体积分数为10%的FCS、2 mol/L谷氨酰胺、50 μg/ml青霉素、50 μg/ml链霉素、10 ng/ml PMA+0.4 μg/ml依诺霉素+1.7 μg/ml莫能霉素),将混合液置于24孔平底板中,同时做平行6孔,在37 ℃、体积分数为5%的CO2、95%湿度条件下培养和激活5 h后,收集细胞1×106/管,共3管,PBS洗2次后,分别加入(Ⅻ)IgG1-FITC; 0CD4-FITC; 1CD4-FITC,各20 μl,置4 ℃暗室孵育30 min,用PBS洗2遍后各加200 μl 10 g/L多聚甲醛,于4 ℃固定15 min,再各自加入(Ⅻ)IgG1-PE; 0IFN-γ-PE; 1IL-2-PE,各20 μl,置4 ℃暗室孵育45 min,用PBS洗2遍后各加500 μl 10 g/L多聚甲醛,用流式细胞仪检测。③用TRIzol试剂提取1×106个BMMNC总RNA,提取的RNA溶于20 μl DEPC处理的水中,测吸光度(A)值,A260/A2801.8,在10g/L琼脂糖凝胶电泳显示证实含18S和28S两条带的标本用于逆转录。cDNA用于进行PCR,IFN-γ引物:5′-AGTTATATCTTGGCTTTTCA,3′-ACCGAATAATTAGTCAGCTT;扩增条件为:94 ℃ 45 s,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,循环35次。IL-4引物:5′-TAGCTTCTCCTGATAAACTA,3′-TCCAAGAAGTTTTCCAACGT;扩增条件:94 ℃ 45 s,56 ℃ 1 min,72 ℃ 90 s, 循环35次。扩增产物用含0.5 μg/ml EB的2 g/L琼脂糖凝胶电泳显示,以DNA相对分子质量标志物为标准,电泳完毕后在紫外灯下观察条带并照相。 4 统计处理 均数间比较采用t检验,率的比较采