固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中磺胺类药物.docxVIP

固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中磺胺类药物 磺胺类药物（sa）是指以对氨基苯甲酸的结构为基础的药物，主要包括磺酰胺、磺间甲氧胺、磺酰胺、甲基丙烯酸酯、磺酰胺和甲基丙烯酸酯。广泛应用于水产养殖中。 动物组织、血液、蛋、奶、蜂蜜中磺胺类药物的检测方法已见诸报道, 主要有薄层色谱法、酶联免疫法、高效液相色谱法或高效液相色谱柱前或柱后衍生荧光检测法。而饲料中多种磺胺类药物的检测方法还未见报道, 本文研究建立了SPE-HPLC-UV测定饲料中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉5种磺胺类药物的方法, 并将该方法用于不同饲料基质中磺胺类药物的测定, 结果令人满意。 1 材料和方法 1.1 水质、速度和波长 5μm, 250 mm×4.6 mm) 。选用乙腈和水作为流动相, 乙腈和水体积比例为25∶75, 流动相的流速为1.0 mL/min;WATERS474二极管阵列检测器, 波长为270 nm;WATERS 717plus自动进样器, 进样量为20μL。 1.2 直接使用的药物 乙腈和甲醇为色谱纯 (Fisher公司) ;冰乙酸为优级纯 (国产) ;其他试剂为分析纯, 国产, 未进一步处理直接使用。磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉标准品 (Sigma公司, 纯度99%) ;碱性氧化铝SPE小柱:Speed SPE Cartridges Alumina Basic ALB (ABI公司) , 规格为1 000 mg/12 mL。 1.3 乙腈溶液乙醇法 分别配制5种磺胺的标准贮备液, 浓度为1 mg/mL, 乙腈溶解 (磺胺喹恶啉用甲醇溶解) 。-20℃冰箱保存1个月。标准工作液现用现配, 用流动相定容。 1.4 样品前处理 1.4.1 饲料中乙腈的提取 称取配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料样品2 g, 置于具塞锥形瓶中, 加入50 mL的乙腈于振荡器振荡提取30 min, 过滤, 滤液备用。 1.4.2 预混合饲料自然流速法 准确吸取试液 (2.4.1) :配合饲料10~20 mL;浓缩饲料、添加剂预混合饲料2 mL, 移入用10 mL乙腈淋洗过的碱性氧化铝小柱中, 令其自然流速流出。待试液全部流出后吹干, 用2次2 mL流动相洗脱, 收集洗脱液, 并过0.45μm的滤膜, 滤液上机测定。 2 结果与讨论 2.1 冰乙酸、乙腈、水和乙酸体积比对色谱图的影响 考察了乙腈+水+冰乙酸流动相体系, 结果如图1所示。通过色谱图可知, 在乙腈、水和冰乙酸体积比为75∶25∶3时最为适宜。在此条件下, 5种磺胺类药物能够达到基线分离。另外, 金霉素、青霉素等药物对其无干扰。 2.2 线性关系与相对标准偏差 在优化条件下, 磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉等5种磺胺类药物在0.2~200μg/mL浓度范围内, 浓度与响应强度具有良好的线性关系, 线性相关系数高于0.999, 相对标准偏差 (RSD) 小于5%。结果见表1。 2.3 样品的预处理 2.3.1 样品测定条件的确定 饲料组成极为复杂, 对磺胺类药物的提取和测定干扰较大。在本研究中, 考察了甲醇、70%酸性甲醇、乙腈和95%乙腈水4种提取剂的提取效果及对测定的影响。 由图2可知以甲醇和70%的酸性甲醇为提取剂时, 色谱图基线不平, 可能影响样品的测定。而95%乙腈水对碱性氧化铝小柱具有穿透作用, 使得目标分析物流失。因此, 选择乙腈作为提取剂。 2.3.2 配合饲料的制备 考察了氧化铝小柱的最大饱和容量, 将标准溶液10μg/mL分别上柱2、5、10、20、30 mL, 结果如表2所示。由表中结果可知, 碱性氧化铝小柱对磺胺类药物的承载量小于200μg。而磺胺类药物在配合料中的添加量约为100~200 mg/kg, 在添加剂预混合饲料中大于1 000 mg/kg, 在称样量为2 g时, 配合饲料上样量定为10 mL;添加剂预混合饲料上样量定为2 mL。 2.3.3 洗脱溶剂及时间 考察了75%乙腈水、25%乙腈水和纯水3种洗脱液, 每次用2 mL洗脱液, 洗脱3次, 结果见表3。由表3可知, 75%的乙腈水洗3次后仍有个别磺胺类药物未被洗脱;而25%乙腈水、纯水在3次洗脱后, 洗脱液中已无任何磺胺类药物。由于25%的乙腈水恰恰是流动相的组成, 因此确定用25%的乙腈水2 mL洗脱2次。 2.4 不同浓度磺胺类药物的加标回收 将该方法用于鸡配合饲料和猪配合饲料中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉等5种磺胺类药物的测定。考察了20、100、200 mg/kg和400 mg/kg浓度水平加标回收, 回收率结果 (5次平均) 见表4、5。在鸡配合饲料中, 4个浓度水平的磺