高效液相色谱-电化学检测生物样品中8种递质含量.docxVIP

高效液相色谱-电化学检测生物样品中8种递质含量 1 织和粉体中单胺类物质的测定方法 单胺类神经过渡的物质包括儿茶酚胺（ca）：脱甲基酯（na）、甲状腺酯（e）、巴巴（da）；5-氨基丙烯酸（5）-ht）及其相关化合物。它们是哺乳动物和人类中枢神经重要的信息传递物质,准确检测其在脑等组织和体液中的含量,对研究这类递质的生理功能、与递质代谢有关疾病如帕金森病(PD)的诊断和药物治疗等基础研究及临床诊断具有重要意义。此类物质的测定方法,国内外均有报道,但能用同样的方法一次处理样品同时测定多种神经递质及其代谢产物的方法报道不多。常见的检测方法主要有电化学检测法、生物法、高效液相色谱荧光检测法和毛细管电泳法、气相色谱、放射示踪等[2~5],但这些方法样品处理都较复杂,成本高,对仪器设备的要求较高,而且费时。本实验旨在建立一种简单、快速、回收率高的样品制备方法,且可在简单配置HPLC-ECD仪上同时测定多种单胺类物质及其代谢产物。并应用于小鼠抑郁模型、大鼠PD模型研究,脐带干细胞诱导单胺能神经细胞的检测中。 2 实验部分 2.1 材料、标准品及溶液配置 CoulochemⅢ型色谱仪(美国ESA公司),包括582型色谱泵、5300型电化学检测器、5011型石墨碳电极、参比电极为金属板、手动进样器、ScientificsoftwareEzchrom elite分析软件;0.45μm滤膜及抽滤器(Millpore);Biofuge 28RS高速冷冻离心机(Heraens);AS3120A超声去气仪(AutoScience);Soniprep 150样品超声破碎仪(SANYO);0.2μm GHP耐酸样品处理器(PALL);PelletPestile电动匀浆仪(Kontes)。 标准品L-DOPA、NE、E、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT及甲醇(色谱纯,Sigma公司);水为超纯水(Milli-Q)。标准品溶液配置:0.01%L-半胱氨酸,0.01mol/LHClO4,0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)。所配标准品避光冷存,使用时逐级稀释至所需浓度。 2.2 样品的制备和细胞的萃取 将动物快速断头,取脑,置于冰上剥离所要组织部位;称重后加入组织裂解液(0.01%L-半胱氨酸,0.2mmol/LHClO4,0.5mmol/LNa2EDTA),置1.5mL离心管中充分匀浆,然后再超生破碎两次,离心15min(14000r/min,4℃);取上清液置另一离心管中,重复离心一次,再次取上清液,-80℃保存。测样品时,将样品冰上融化后再次离心后过0.2μm的耐酸过滤器。然后取20μL进样。 细胞的处理可选在不同时间收集细胞或培养上清液,经上述裂解液短暂超声后离心萃取递质。 样品经HClO4处理后呈强酸性,有些色谱柱不能耐受强酸性范围,为了保护色谱柱,可加入一半样品体积的钾盐沉淀(20mmol/L柠檬酸钾,300mmol/LK2HPO4,2mmol/LNa2EDTA),冰预10min后离心(同前),取上清液再进样。 2.3 流动相l-ms-l-4-甲基苯磺酸酯 采用ESA MD-150色谱柱(150mm×3.2mm,2.0μm),日本资生堂C18预柱(10mm×3mm,3μm)。流动相为5%~10%甲醇(色谱纯),50mmol/L柠檬酸、50mmol/L无水乙酸钠、0.5mmol/L1-庚烷基磺酸钠、0.5mmol/LNa2EDTA、5mmol/L三乙胺。流速:0.3~0.5mL/min,柱温:30℃,进样量:20μL,pH:3.5。 3 结果与讨论 3.1 流动相及色谱柱的选择 单胺的色谱分离多用3种较适宜的缓冲体系:柠檬酸缓冲体系(柠檬酸-乙酸盐、柠檬酸-柠檬酸三钠盐)、单氯乙酸和磷酸盐缓冲体系,且以第一种为最佳[4~7]。缓冲液浓度一般为50~100mmol/L,浓度太高易析出结晶导致管线堵塞,增加洗脱难度;浓度太低样品峰不稳,经反复实验选择50mmol/L;流动相中有机系一般可选乙腈或甲醇,鉴于乙腈毒性和价格较高,选择甲醇作为流动相。单胺类递质及代谢产物有碱性NE、E、DA、L-DOPA、5-HT,酸性DOPAC、HVA、5-HIAA等。用简单非梯度洗脱系统分离它们的混合物是困难的,本实验将1-庚烷磺酸钠加入柠檬酸-乙酸钠缓冲液,并加入适量甲醇,8种单胺类递质可在这种恒组成流动相洗脱下分离完全。优化流动相时发现甲醇浓度、离子对浓度、缓冲液pH值、温度及柱压等均影响色谱分离,前三者为主要因素。为稳定pH及防止样品峰拖尾加入5mmol/L三乙胺。在流速恒定情况下,适度增加甲醇的浓度;或固定甲醇浓度,适当增加流速,都可缩短分离时间,但都不影响色谱峰的相对位置,且都对先洗脱的3种物质出峰时间影响不大,对后5种影响大。通过