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尖吻蛇血凝酶止血作用机制的研究 中毒的那几个周期会影响身体的凝血过程，包括类似于凝血酶的丝状丙烯酸（fpa）或pb。它可以直接影响纤维素a的原始释放（fpa）或fpb。这是一种由纤维素酶引起的共结合酶，并被称为svts。SVTLEs作为一种动物来源的蛋白酶类止血药,兼有毒性低、起效快、药效持久且不引起血管内栓塞等优点,引起国内外学者研发SVTLEs类药物的浓厚兴趣。第1个用于临床的SVTLEs类止血药是1963上市的注射用蛇毒血凝酶(reptilase,商品名:立止血)。自20世纪90年代开始,立止血在中国被广泛用于止血,包括各种手术出血、消化道出血和妇科出血等,并由此引发了国内开发SVTLEs类止血药物的热潮。 康辰医药股份有限公司经过长期研究,从国内尖吻蝮蛇蛇毒中分离出一种新的具有止血作用的SVTLEs,并于2009年作为国家一类新药(注射用尖吻蝮蛇血凝酶,saculin,商品名苏灵)被批准上市。saculin采用蛇毒单体提纯技术,使单一组分纯度达到99%,是迄今为止我国上市产品中惟一完成全部氨基酸测序的单一组分的SVTLEs类药物。前期研究表明,saculin作为高度纯化的单一蛋白,其止血机制主要是作用于纤维蛋白原释放Fp A,不激活FXIII,临床应用表明其具有很好的止血作用,而且不良反应轻,耐受性好。本文在前期研究的基础上,进一步考察saculin止血作用机制及对血液系统的影响,为临床合理用药提供参考。 材料表面 1 凝血酶、人纤维素、白砂糖的含量 注射用尖吻蝮蛇血凝酶(saculin,商品名:苏灵)由康辰医药股份有限公司提供,批号规格:每瓶6 U;注射用血凝酶(商品名:立止血)由瑞士素高药厂提供,规格:每瓶1 k U;人凝血酶购自美国Sigma公司,批号:087K7570,规格:每瓶200 U;人纤维蛋白原购自美国Sigma公司,批号:108K7535,规格:每瓶250 mg;FXIII购自美国Innovate Research公司,规格:0.25 mg;FX购自美国Innovate Research公司,规格:100 U;凝血酶原购自美国Innovate Research公司,规格:100 U。 2 色谱分析系统 1200系列高效液相色谱系统(美国Agilent公司);Agilent C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm,美国Agilent公司);HP3400荧光/可见数字图像分析系统(美国Alpha公司);酶标仪(美国Bio-Rad公司);BS124S型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。 方法 1 pa-sac融合法测定聚乙二醇fpa及fpb产品的hplc分析 使用0.05 mol·L-1Tris-HCl(p H 7.4)缓冲液分别配制4 U·m L-1saculin溶液、20 mg·m L-1纤维蛋白原溶液、50μg·m L-1Fp A和50μg·m L-1Fp B标准品溶液。每次取人纤维蛋白原、saculin溶液各0.5 m L混合均匀,置于37℃水浴不同时间后以沸水煮5 min终止反应,13 000 r·min-1离心10 min,取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。与Fp A及Fp B标准品的HPLC图谱进行对比分析。色谱条件为C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相超纯水(含0.01%三氟乙酸)-乙腈(8∶2),等度洗脱,流速1 m L·min-1,检测波长210 nm。 2 sds-东南角分析 使用Tris-HCl缓冲液分别配制8 mg·m L-1纤维蛋白原溶液、4 U·m L-1saculin溶液、2 k U·m L-1立止血溶液、8 U·m L-1人凝血酶溶液。取0.25 m L纤维蛋白原、5μL 0.8 mol·L-1的Ca Cl2和10μL FXIIIa混合,加入0.25 m L saculin混匀后置于37℃水浴不同时间,加入5 mol·L-1尿素溶液(内含2%SDS,2%β-巯基乙醇,0.1 mol·L-1磷酸钠,p H 7.15)0.5 m L,待纤维蛋白凝块溶解后,将样品进行SDS分析。同时以Tris-buffer、立止血和人凝血酶分别代替saculin重复实验作为对照。 3 酶抑制剂的选择 将纤维蛋白原用TBS溶液(0.04 mol·L-1TrisHCl,0.15 mol·L-1Na Cl,p H 8.3)稀释至40μg·m L-1,以每孔100μL包被酶标板;洗涤后用3%BSA封闭各孔,然后依次加入60μL FXIII、10μL saculin(80 U·m L-1)、10μL 50 mmol·L-1Ca Cl2、100μL5 mmol·L-1生物素化戊胺和10μL 50 mmol·L-1DTT,混匀后