第四章酶的分离纯化.pptVIP

一般将只能透过溶剂而不能透过溶质的薄膜视为理想的半透膜。当把相同体积的稀溶液（如淡水）和浓液（如海水或盐水）分别置于一容器的两侧，中间用半透膜阻隔，稀溶液中的溶剂将自然的穿过半透膜，向浓溶液侧流动，浓溶液侧的液面会比稀溶液的液面高出一定高度，形成一个压力差，达到渗透平衡状态，此种压力差即为渗透压。渗透压的大小决定于浓液的种类，浓度和温度与半透膜的性质无关。若在浓溶液侧施加一个大于渗透压的压力时，浓溶液中的溶剂会向稀溶液流动，此种溶剂的流动方向与原来渗透的方向相反，这一过程称为反渗透。 Colloids胶体颗粒。 晶体沉淀——分子排列有规则 蛋白质沉淀 非晶体沉淀——分子排列无规则 （无定形沉淀） 晶体内部有规律的结构决定了晶体的形成必须是相同的原子、离子或分子。 过饱和溶液的形成是结晶的原推动力和首要条件。 * 当前第126页\共有142页\编于星期三\11点 （一）结晶的条件 酶的纯度 纯度越高越易结晶（ 50％ ） 2.酶的浓度 （恰到好处） 浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。 3. 结晶温度 4. 溶液pH 5.离子强度 6. 晶核 7.结晶时间 * 当前第127页\共有142页\编于星期三\11点 （二）结晶的方法 1. 除去一部分溶剂，如蒸发浓缩使溶液达到过饱和状态而析出晶体 ; 2. 不除去溶剂，而在溶液中加入沉淀剂，如中性盐、有机溶剂等。 盐析法 如，前述的 有机溶剂法 均可用于结晶 等电点 * 当前第128页\共有142页\编于星期三\11点 常用的结晶方法：透析平衡结晶法 将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。 前提：酶液要达到一定纯度（经过纯化）。 酶液要浓缩到一定浓度。 * 当前第129页\共有142页\编于星期三\11点 Resolution（分辨率） Speed（速度） Capacity（容量） Recovery（回收率） 一、 设计分离纯化工艺的基本要求 第六节 纯化方案的设计与评价 * 当前第130页\共有142页\编于星期三\11点 二、纯化方案的设计 （一）纯化方法的选择依据 根据有效成分和杂质之间理化性质的差异 调节溶解度：沉淀法 2. 根据分子大小、形状的不同： 离心分离，膜分离，凝胶过滤 3. 根据分子电荷性质的不同： 离子交换层析，电泳 4. 根据专一性结合的方法：亲和层析 5. 其它：吸附层析，疏水层析 * 当前第131页\共有142页\编于星期三\11点 * 当前第132页\共有142页\编于星期三\11点 （二）纯化方法的排序 先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。 * 当前第133页\共有142页\编于星期三\11点 三、纯化方案的评价 （一）酶活力测定： 酶活力(enzyme activity)又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反应速率来表示。 一般用单位时间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率 。 * 当前第134页\共有142页\编于星期三\11点 方法： 在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。 * 当前第135页\共有142页\编于星期三\11点 常用的方法 ： 1. 化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液 。 2. 分光光度法： 利用底物和产物光吸收性质的不同 。 3. 量气法： 酶促反应中产物或底物之一为气体。 4. 滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用pH电极测。 * 当前第136页\共有142页\编于星期三\11点 常用终止反应方法： 1）改变反应最适条件： 加酸、碱、加热、降温 2）加酶变性剂： 5％三氯乙酸 * 当前第137页\共有142页\编于星期三\11点 酶活力单位： 通常