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细胞或细胞系常用培养基 当前第61页\共有100页\编于星期四\7点 YOCON细胞培养基生产工艺 当前第62页\共有100页\编于星期四\7点 细胞培养基产品在流感病毒分离上的应用 流感病毒分离所需培养基及试剂 DMEM(高糖，含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠） 胎牛血清 0.05%胰酶+0.02%EDTA 青链霉素（10000u/ml，10000ug/ml） 庆大霉素（50mg/ml） Hepes（1M） BSA(v) 7.5% TPCK-胰酶（2mg/ml） HBSS 当前第63页\共有100页\编于星期四\7点 相关试剂用量 当前第64页\共有100页\编于星期四\7点 病毒CPE反应 当前第65页\共有100页\编于星期四\7点 病毒液的收获 当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。 收获的病毒液可以进行红细胞凝集实验，如没有红细胞凝集现象，应将收获病毒培养液再MDCK细胞传代2-3次。 如果有必要，可再通过血凝抑制实验鉴定分离物，并将分离物保存在-70℃或-70℃以下。 当前第66页\共有100页\编于星期四\7点 质控及检测能力 先进的检测仪器 标准的检测操作流程 每个批产品的监测和留样 符合GMP标准的检测环境 当前第67页\共有100页\编于星期四\7点 产品相关质控方法出处 pH 依据中华人民共和国药典2010年版二部附录VI H pH测定法. 无菌 依据中华人民共和国药典2010年版 二部 附录XI H 无菌检查（2） 直接接种法，进行细菌真菌的检测。 内毒素 依据中华人民共和国药典2010年版 二部 附录XI E 细菌内毒素检查法中凝胶半定量法，利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素。 支原体检测 依据中华人民共和国药典2010年版 二部 附录Ⅻ B 支原体检查法中培养法 当前第68页\共有100页\编于星期四\7点 SP2/0毒性检测 依据《中国生物制品主要原辅料质控标准》中SP2/0生长曲线，倍增时间的测定 渗透压 依据中华人民共和国药典2010年版 二部 附录IXG 渗透压摩尔浓度测定法中（1）测量溶液的冰点下降来间接测定其渗透压摩尔浓度。 凝胶电泳图谱 依据中华人民共和国药典2010年版 三部 附录 F电泳法第四法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 蛋白总量 依据中华人民共和国药典2010年版 二部 附录Ⅶ M 蛋白质含量测定法第五法（考马斯亮蓝法 Bradford） 当前第69页\共有100页\编于星期四\7点 为达到质控标准采取的措施 当前第70页\共有100页\编于星期四\7点 细胞培养基相关试剂 平衡盐及缓冲液 细胞消化试剂 pH调节试剂 营养添加剂 抗生素 细胞冻存液 当前第29页\共有100页\编于星期四\7点 平衡盐及缓冲溶液 PBS PBS是生物学研究和组织培养中常用的一种缓冲溶液。例如，细胞或组织的运输，细胞计数时的稀释，溶液的配制，容器，包括细胞的清洗等，但不能用于细胞及组织块的消化。 DPBS 配方中无钙镁离子，不会中和胰酶及EDTA活性，用于贴壁和团块细胞的消化解离，细胞解离前的清洗。 当前第30页\共有100页\编于星期四\7点 HBSS HBSS可用于多种细胞培养应用，如细胞解离前的清洗，细胞或组织的运输，细胞计数时的稀释，溶液的配制等。含钙和镁的HBSS配方一般用作运输培养基或试剂配制，无钙镁的HBSS用于细胞解离前的清洗，不会降低胰酶的活性 当前第31页\共有100页\编于星期四\7点 细胞消化试剂 0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 胰蛋白酶是一种胰腺丝氨酸蛋白酶，具有底物特异性，解离消化作用强，被用于组织培养中贴壁细胞的传代。但细胞培养环境中存在的二价阳离子，如钙和镁等可以抑制解离。EDTA可螯合二价离子，从而增强胰蛋白酶的作用。 当前第32页\共有100页\编于星期四\7点 影响胰酶消化细胞的因素 胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca2+、Mg2+离子和血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0 , 温度37℃ 其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养