2023版高中生物选择性必修3人教版 第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序.pptxVIP

第3章 基因工程第2节 基因工程的基本操作程序1 目的基因的筛选与获取目的基因:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,主要是指编码蛋白质的基因。筛选目的基因的方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。利用PCR获取和扩增目的基因PCR(聚合酶链式反应):在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。原理:DNA半保留复制。前提:要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。第3章 基因工程(4)DNA复制所需的基本条件组分 作用解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料DNA母链 提供DNA复制的模板DNA聚合酶 催化合成DNA子链引物 使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸第3章 基因工程(5)PCR反应过程过程 说明变性 当温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链图解复性 当温度下降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸 当温度上升到72 ℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新 的DNA链(6)鉴定方法:琼脂糖凝胶电泳。第3章 基因工程2 基因表达载体的构建——基因工程的核心目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;同时,使目的基因能够表达和发挥作用。组成:目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等。(1)启动子:位于基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录。 (2)终止子:位于基因的下游,终止转录。3.构建过程:限制酶切割载体,使其出现一个切口→用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段→利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处,形成重组DNA分子。第3章基因工程1.方法3将目的基因导入受体细胞生物种类方法受体细胞植物农杆菌转化法、花粉管通道法体细胞或受精卵动物显微注射技术受精卵微生物2+Ca 处理法原核细胞第3章 基因工程2.农杆菌转化法(1)转化的概念:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 (2)农杆菌的特点:农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上。(3)转化过程:将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上→获得表现出新性状的植株。第3章 基因工程4 目的基因的检测与鉴定检测水平检测方法通过PCR 等技术检测生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA。从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测目的基因是否翻译出蛋白质等分子水平个体生物学水平通过接种实验进行抗性特性及抗性程度的鉴定第3章 基因工程5 DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理(1)利用PCR在体外扩增DNA片段的原理: DNA热变性、DNA半保留复制。 (2)DNA片段电泳鉴定的原理①DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速 率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。③凝胶中的DNA分子通过染色, 可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。第3章 基因工程2.实验步骤(1)PCR加样:用微量移液器按照配方或说明书,在微量离心管中依次加入各组分。 (2)离心。扩增:将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。配制琼脂糖溶液:用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液(质量分数一般为0.8%~1.2%),并加入适量的核酸染料混匀。制备凝胶:将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具,插入合适大小的梳子以形成加样孔。 (6)加缓冲液:将凝胶放入电泳槽内,加入缓冲液没过凝胶1 mm。加样:将PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)的混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。电泳并观察结果。第3章 基因工程3.注意事项为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 ℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。在进行操作时,一定要戴好一次性手套。第3章 基因工程知识辨析利用PCR扩增目的基因所需的酶与体内DNA复制所需的酶相同,这种说法正确吗?不正确。体内DNA复制所需的酶有解旋酶和DNA聚合酶,而PCR所需的酶是耐高温的 DNA聚合酶,