有氧运动通过上调Dhcr24改善H2O2诱导的心肌细胞凋亡机制研究.docx

? ? 有氧运动通过上调Dhcr24改善H2O2诱导的心肌细胞凋亡机制研究 ? ? 董艾艾 陈 严 周建妹 心肌梗死是心力衰竭的重要诱因之一，每年死亡率接近5%，发病率不断上升[1]。心肌梗死后的运动训练有利于患者康复、提高生活质量，有助于预防梗死后的并发症，找到心肌梗死后运动康复的有效靶向分子非常重要[2]。24-脱氢胆固醇还原酶（Dhcr24）是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖性氧化还原酶家族的成员。Dhcr24 作为一种多功能蛋白质，具有胆固醇合成和抗凋亡活性[3]。心肌细胞凋亡是心肌细胞损伤的重要病理生理机制[4]。研究证明，Dhcr24 可显著抑制氧化应激和缺氧诱导的心肌细胞凋亡和心肌梗死[5]。在此背景下，本研究通过H2O2建立心肌细胞凋亡模型[6]，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）在运动后被激活[7-9]，通过AMPK 激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）来模拟心肌细胞的运动效果，研究Dhcr24 在有氧运动改善心肌梗死后心肌细胞功能中的潜在作用。 1 材料与方法 1.1 细胞株与主要试剂 大鼠心肌细胞系H9C2（批号RDCL-012）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；DMEM 培养基（批、胎牛血清（批购自美国Gibco 公司；H2O2（批号88597）购自美国Sigma 公司；AICAR（批号2627-69-2）购自美国Selleck Chemicals 公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（批号MA0220）购自大连美仑生物技术有限公司；One-Step TUNEL 凋亡试剂盒（批号C1088）、RIPA 蛋白裂解液（批号P0013C）、ECL 化学发光试剂盒（批号P0018AFT）购自上海碧云天生物技术公司；BCA 蛋白定量试剂盒（批购自美国Thermo 公司；Dhcr24（批号ab137845）、B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）（批号ab182858）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）（批号ab32503）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（批号ab8245）抗体购自Abcam 公司；Trizol（批 购自美国Invitrogen 公司；cDNA 合成试剂盒（批购自美国Thermo 公司；SYBR Premix Ex Taq ⅡPCR 试剂盒（批号RR820A）购自日本TAKARA 公司。 1.2 主要仪器 高速冷冻离心机（Thermo Fisher，型号：Fresco 17）、1300 系列Ⅱ级A2 型生物安全柜（Thermo Fisher，型号：1379）、CO2培养箱（Thermo Fisher，型号：BB150）、荧光定量PCR 仪（罗氏，型号：LightCycler480Ⅱ）、荧光倒置显微镜（尼康，型号：TiS）。 1.3 细胞培养与处理 H9C2 细胞培养在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、10 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基中，细胞在37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。为了构建细胞凋亡模型，取对数期细胞接种至96 孔板中，通过100 μmol 的H2O2处理细胞4 h[6]。通过AMPK 激动剂AICAR（1 mmol）模拟H9C2 细胞的运动效应[7]。 1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞处理后通过0.05%胰蛋白酶将细胞消化为单细胞悬液，1000 r/min离心5 min 后加入200 μL 结合缓冲液重悬细胞，滴加Annexin V（10 μg/mL）和PI（10 μg/mL），避光孵育15 min，然后通过流式细胞仪分检测细胞凋亡情况。 1.5 TUNEL 检测细胞凋亡 通过一步法TUNEL 凋亡试剂盒检测细胞凋亡。细胞（1×105/孔）接种至玻璃盖玻片上，通过4%甲醛固定30 min、0.3% Triton X-100 透化10 min。玻片通过dUTP 和TDT 酶在37 ℃加湿箱中标记1 h，通过抗荧光淬灭封膜剂进行封膜，通过荧光显微镜观察阳性粒子。 1.6 蛋白免疫印迹检测细胞Dhcr24、Bcl-2、Bax 表达水平 细胞处理后，通过1% PMSF 的RIPA 裂解液裂解细胞，提取总蛋白，并通过BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，等量上样（30 μg）。经SDSPAGE 电泳，转至PVDF 膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗Dhcr24（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、GAPDH（1∶1000），4 ℃下孵育过夜，洗膜后加入HRP-羊抗兔二抗（1∶10000），室温下孵育2 h。通过ECL 化学发光显色对待测物进行分析。 1.7 RT-qPCR 检测细胞