基因操作实验技术实验报告.doc

PAGE PAGE 8 实验一 质粒DNA的提取、酶切、电泳鉴定 一 实验目的 1、熟练掌握质粒DNA提取的操作方法以及酶切电泳操作； 2、理解质粒DNA提取的原理。 二 实验原理 这一方法的基本原理是在含强阴离子洗涤剂的碱性溶液中细胞破裂而染色体和蛋白质变性，并和破裂的细胞壁互相缠绕成大型复合物，分子量较小的质粒DNA和RNA释放到上清液中，前者被被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效的沉淀下来。用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，这时染色体和其他成分形成的复合物是比较脆弱的，如动作过于剧烈或处理时间过长则会有较多的染色体释放到清夜中在随后用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，由于质粒和染色体均属于DNA因此两者很难再被分开。硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。质粒提取试剂盒就是根据这一原理实现质粒的快速纯化。 三 实验材料仪器及详细实验步骤 用硅胶膜分离法提取质粒将提取的质粒进行酶切分析酶切产物的电泳鉴定 （详细的实验步骤和材料仪器请参考实验讲义） 四 实验结果与分析讨论 M 12-3 12-4 12-5 13-1 13-2 13-3 13-4 图1.质粒pLac18酶切结果 上图中13-2对应电泳条带是本组的实验结果。由图可知，本组实验结果较好，条带亮度高，说明质粒提取成功，可以顺利进行下面实验。 五 注意事项 （1）加入溶液II和溶液III后操作要缓慢轻柔，不可剧烈振荡。动作过于剧烈或处理时间过长则会有较多的染色体释放到清夜中，用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，由于质粒和染色体均属于DNA因此两者很难再被分开； （2）结合缓冲液低温时会出现结晶，使用时看是否已经结晶，如有需加热使结晶化开，在吸附柱中加入结合缓冲液后操作要迅速，以防柱内停留时间过久降温出现结晶； （3）洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率； （4）除去残留液体从离心机中拿出样品时要竖着拿，避免酒精碰到质粒，对酶切以后的工作产生影响。 （5）随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低，为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积，洗脱时间对回收率也会有一定影响。 （6）质粒酶切的时候，试剂的量比较小，要保证质粒、限制性内切酶缓冲液M都加入到离心管管底以充分混匀而不是残留在管壁上。 总之，在此次实验的提取过程中，最重要的是把握好使用溶液的剂量和时间，以及溶液的震荡程度和离心时间；电泳时加样要稳而准，以免样品扩散或碰到凝胶上。实验二 嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因的PCR扩增以及PCR产物的纯化 一 实验目的 学会PCR实验技术的原理，并且掌握PCR的操作方法。 一 实验原理 PCR是一项特异性DNA序列的体外酶促合成方法。它是利用2个寡聚核苷酸作为引物与对应的DNA链的目的区域的侧翼杂交，经过模板变性作用，引物退火和耐热DNA聚合酶酶促引物延伸，周而复始的重复产生特定片段，该片段的末端由引物的5’端决定。 三 实验材料仪器及步骤 淀粉酶基因的PCR扩增与鉴定用硅胶柱纯化PCR产物PCR产物的酶切及电泳鉴定（实验材料仪器以及详细的实验步骤请参考实验讲义） 四 实验结果与讨论 M 11-1 13-1 13-2 13-3 13-4 15-1 15-2 图2 PCR产物酶切电泳鉴定结果 上图中13-2对应的电泳条带是本组的实验结果。观察图可知，本组条带亮度较好，说明PCR产物提取成功。 五 注意事项 影响PCR的因素主要有：酶、引物、模板浓度及酶的质量，dNTP浓度，Mg2+浓度，退火温度，循环次数等，影响因素复杂。所以在PCR扩增操作时要认真严格，尽量在最适条件下进行，把握好PCR温度和时间，在用硅胶柱纯化PCR产物时，可以适当增加离心回收次数，使实验效果更好。 实验三 感受态大肠杆菌JM109制备 一 实验目的 学会如何制备感受态细胞 二 实验原理 在一个生长过程中的细菌培养物中，只有某一阶段的细胞才能作为转化的受体。细胞能接受转化的生理状态叫感受态。处于感受态的细胞表面存在DNA受体蛋白和一些其他的转化特异性蛋白。本实验是通过冰冷却的氯化钙处理大肠杆菌使其细胞膜的通透性发生改变，从而使带有外源DNA的载体容易进入受体细胞，通过复制与表达，使受体细胞获得新的遗传性状。 三 实验材料仪器及步骤 实验详细步骤请参考实验讲义 四 实验结果与讨论 要获得较高的转化率的关键是保持低温，即菌液离开冰水的时间要尽可能短；此实验中采用对数生长期的大肠杆菌，而且越前期越好，因为此时期外源DNA不易被降解；所制得的感受态细胞浓度越高越好。 实验