基于pcr-rflp技术的linux单核苷酸多态性与食鳞状细胞癌高发区人群的遗传易感性研究.docxVIP

基于pcr-rflp技术的linux单核苷酸多态性与食鳞状细胞癌高发区人群的遗传易感性研究 0 xpa的多态性 身体的dna修复系统在维持组功能的完整性和由修复引起的损伤方面发挥着重要作用。DNA 修复能力(DNA repair capacity, DRC)低下与癌症风险增高相关。核苷酸切除修复(Nucleotide eacision repair, NER)是人类最主要和最灵活的的DNA损伤修复途径。 XPA是一种进化保守的DNA修复酶,在核苷酸切除修复通路中,它与RPA、XPC、TFIIH、XPG、ERCC1-XPF复合体及DNA聚合酶一起共同作用,完成DNA的修复。XPA多态性的改变可能会影响其蛋白质的功能进而改变个体DNA的损伤修复能力。XPA多态性与肺癌相关研究已有报道。但有关XPA多态性与食管癌和贲门癌关系的研究尚未见报道。 本研究应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)分析方法,探讨XPA基因多态性与河北省食管癌、贲门癌高发区—磁县和涉县人群食管鳞状细胞癌(ESCC)和贲门腺癌(GCA)遗传易感性的关系。 1 数据和方法 1.1 病例选择及资料收集 327名食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者、253名贲门腺癌(Gastric cardiac adenocarcinoma,GCA)患者均来自河北省食管癌、贲门癌高发区磁县和涉县,612名健康对照为在相同地区相同时间体检为正常人群,并经本人知情同意,由专门的登记员调查所有研究对象的性别、年龄、吸烟史及上消化道肿瘤家族史。现吸烟或曾吸烟每天5支以上并持续两年或两年以上者定义为吸烟个体。家族中有1名以上一级亲属和(或)2名以上二级亲属患有食管癌/贲门癌/胃癌者定义为上消化道肿瘤(Upper gastrointestinal cancer, UGIC)家族史阳性。 1.2 枸杞酸钠抗凝 所有研究个体均采集静脉血5ml,经枸橼酸钠抗凝,4℃冰箱保存。采血后一周内,以蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法,提取外周血淋巴细胞染色体DNA。 1.3 pcr和g/g基因型检测 XPA A23G基因型检测应用PCR-RFLP方法进行。XPA基因A23G的 PCR反应体系为20μl,其中模板DNA 100ng,10×PCR缓冲液(MgCl2free)2μl, MgCl22.5mM,Taq DNA聚合酶(赛百胜公司,北京)2.0U,dNTPs 200μM,上游引物5’-TTAACTGCGCAGGCGCTCTCACTC-3’和下游引物5’-AAAGCCCCGTCGGC CGCCGCCAT-3’各200nM。PCR反应条件为:94℃预变性5min后, 94℃变性30s、58℃退火20s、72℃延伸20s,35个循环后,72℃继续延伸7min。PCR产物经限制性内切酶MspI(宝生物公司,大连)于37℃酶切16h后,进行4%琼脂糖凝胶电泳。A/A基因型由于缺乏MspI的识别位点保持原有PCR后的158bp的片段,而G/G基因型存在MspI的识别位点产生130和28bp两条DNA片段,A/G基因型则表现为158bp、130bp和28bp三条片段,见图1。 XPA G709A基因型检测应用PCR-RFLP方法进行。XPA基因G709A的 PCR反应体系为20μl,其中模板DNA100ng,10×PCR缓冲液(MgCl2free)2μl,MgCl22.5mM ,Taq DNA聚合酶(赛百胜公司,北京)2.0U,dNTPs 200μM,上游引物5’-TTCATATGTCAGTTCATG-3’和下游引物5’-TTTTTCAGAATTGCGT-3’各200nM。PCR反应条件为:94℃预变性5min后, 94℃变性45s、50℃退火45s、72℃延伸45s,35个循环后,72℃继续延伸7min。PCR产物经限制性内切酶Taqa1(宝生物公司,大连)于65℃酶切16h后,进行4%琼脂糖凝胶电泳。G/G基因型存在Taqa1的识别位点产生130bp和18bp两条片段,而A/A基因型由于缺乏 Taqa1的识别位点保持原有PCR后的148bp的片段,G/A基因型则表现为148bp、130bp和18bp三条片段。 为进行基因型检测的质量控制,每一批PCR反应均以灭菌蒸馏水替代模板DNA作为阴性对照,XPA A23G随机挑取10%进行重复实验。 1.4 基因型分布的比较 经卡方检验比较基因型频率的观察值与预期值,进行Hardy-Weinberg平衡分析。病例组和对照组的XPA基因型及等位基因型分布比较采用行×