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6种常用中药中核苷类成分的测定 格林威治是生物细胞维持生命的重要药物，具有免疫调节、改善细胞代谢、镇静中枢神经等生理活性。目前核苷已作为药品、保健品和食品添加剂在市场上销售,也是一些补益中药如冬虫夏草和灵芝的质量控制指标。作者认为,核苷可能是补益中药的共有物质基础,但核苷类成分在其他补益中药中的分析少见报道。本文应用高效液相色谱法测定了除冬虫夏草、灵芝和三七外的6种常用补益中药人参、黄芪、熟地黄、当归、麦冬和肉苁蓉中尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷的含量,以明确被测成分在此6种中药中的含量,为探究核苷类化合物在补益中药中的作用奠定基础。 1 药材、药品和试剂 Agilent 1100高效液相色谱仪,包括四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器及化学工作站(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA);Millipore Milli-Q Plus超纯水制备系统(Millipore,Bedford,MA,USA);平行反应器(BUCHI-Syncore,Flawil,Switzerland)。 黄芪、熟地黄、麦冬、肉苁蓉购自广东珠海市药店,人参采自吉林抚松县,当归采自甘肃岷县,药材经澳门大学中华医药研究院李绍平教授鉴定,分别为膜荚黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.]、地黄(Rehmannia glutinosaLibosch)、麦冬[Ophiopogon japonicus(Thunb.)Ker-Gawl]、管花肉苁蓉[Cistanche tubulosa(Schenk)Wight]、人参(Panax ginsengC.A.Mey)和当归[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]的相应药用部位。对照品尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷购自Sigma公司(St.Louis,MO,USA),纯度均大于98%。乙腈为色谱纯,购自Merck公司;甲酸为分析纯,购自广东省光华化学有限公司。水为Milli-Q水。 2 线性关系和定量限、回收率试验 2.1对照品储备液的制备 准确称取对照品尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷适量,分别置于5 mL量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,制得尿苷(77.32 μg·mL-1)、腺嘌呤(58.29 μg·mL-1)、鸟苷(90.73 μg·mL-1)、腺苷(157.07 μg·mL-1)的对照品储备液。 2.2供试品溶液的制备 取干燥药材粉末(60目筛)0.5 g,精密称定,精密加水15 mL后称重,平行反应器100 ℃提取90 min,用水补足失重,提取液13000 r·min-1离心5 min,上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。 2.3色谱条件 Zorbax SB-Aq分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为0.05%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～12 min,0% B;12～17 min,0% B→2% B;17～27 min,2% B;27～45 min,2% B→20% B),流速0.5 mL·min-1;检测波长260 nm;柱温30 ℃;进样量15 μL。在此条件下,尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷均达到基线分离,样品中成分对分析无明显干扰(麦冬除外,其成分对腺嘌呤分析有明显影响),见图1。 1.尿苷(uridine) 2.腺嘌呤(adenine) 3.鸟苷(guanosine) 4.腺苷(adenosine) 2.4线性关系考察 分别准确量取尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的对照品储备液适量,加水稀释成6个浓度的系列对照品混合溶液,以0.45 μm微孔滤膜过滤后供HPLC分析。以各对照品峰面积Y对浓度X(μg·mL-1)进行线性回归。尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的回归方程及最低检测限(LOD,S/N=3)和最低定量限(LOQ,S/N=10)见表1。 2.5精密度考察 取同一份对照品混合溶液,同一天连续进样6次,计算各峰面积,考察日内精密度;每天进样2次,连续测定3 d,计算各峰面积,考察日间精密度。结果尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的日内精密度RSD(n=6)分别为0.1%,0.1%,0.0%,0.1%;日间精密度RSD(n=6)分别为 0.5%,0.2%,0.7%,1.0%。 2.6重复性考察 精密称取同一当归样品粉末0.25 g、0.50 g、0.75 g各3份,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,分别测定,计算峰面积,结果低、中、高浓度下,尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷含量平均值(n=3)分别为151,87,187,270 μg·g-1;RSD分别小于1.4%,2.7%,4.5%,2.1%。 2.7加样回收率考察 精密称取已知含量的当归(甘肃岷县)粉末3份,每份约0.25