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不同菌株产蛋白酶条件及性质的比较 毛霉、米曲霉和少旭霉是传统发酵豆类的一般发泡剂。毛霉是生产腐乳、腊八豆、豆豉等风味食品的主要菌种,米曲霉则是豆酱、酱油等的生产菌种,少孢根霉是印尼天培的主要生产菌种,这3个菌种都具有很强的分解蛋白质和脂肪的能力,并能产生各自独特的风味。在发酵豆制品的生产中,菌种产生和分泌蛋白酶能力的强弱直接影响到产品的成熟度和风味,因此研究这些菌种产生蛋白酶的条件及蛋白酶的性质具有重要的现实意义。本课题组一直致力于毛霉蛋白酶系的研究,在研究中发现毛霉产生蛋白酶的能力与米曲霉产生蛋白酶的能力相比有较大的差异,但这并不影响毛霉发酵豆制品腐乳以及毛霉型豆豉的成熟度。根霉和毛霉相比同属担子菌纲、藻状菌科,但生长温度比毛霉高,有研究者曾尝试以根霉来酿造腐乳,以期解决夏季高温情况下腐乳生产的难题,经过文献检索发现Wang等对少孢根霉的蛋白酶系做过一系列的研究,但对这3种发酵豆制品的菌种的蛋白酶系的比较尚未见报道。因此本论文对3个菌种的产蛋白酶能力及其蛋白酶的性质进行了比较,以期为3个菌株的广泛应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 培养基和试剂 菌种:雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)AS3.2778,北京王致和腐乳厂提供;米曲霉(Aspegillus oryzae)3.042,购于广东省微生物研究所;少孢根霉(Rhizopus oligosporus)CICC 3152,购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。 斜面培养基:均采用PDA培养基。 固体发酵培养基:10 g麸皮(加水比例1∶1.0),装于250 mL三角瓶中,灭菌后备用(培养基灭菌条件均为121℃,20 min)。 试剂:酪蛋白为生化试剂;除Folin-酚试剂自制外,其余试剂均为分析纯。 1.2 生物培养和冷冻 JM-5001型电子天平;YX-280D不锈钢受体高压灭菌锅;PYX-190S-A型生化培养箱;Laborluxll光学显微镜;CR-22G型高速冷冻离心机;722型分光光度计;H.S.G电热恒温水浴锅。 1.3 方法 1.3.1 粗酶液的提取 在固态发酵培养基中接种1 mL菌悬液(孢子数约为106个),摇匀,放入生化培养箱中培养。按干曲10倍体积加无菌水,分散均匀,4℃下浸提过夜。4层无菌纱布过滤,滤液置于无菌三角瓶中。将滤液于4℃、8 000 r/min进行冷冻离心,上清液即粗酶液。分装粗酶液,置低温冰箱-20℃保存备用,粗酶液制备完成。 1.3.2 蛋白酶活力 采用Folin-酚法。酶活力定义为:在40℃,一定pH条件下,1 min内催化酪蛋白水解产生1 μg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位(U)。酸性、中性、碱性蛋白酶活力分别在pH 3.0、pH 7.2、pH 10.0的条件下进行测定。由Folin-酚法得到酪氨酸标准曲线如图1所示。 1.3.3 种霉菌产酶活力测定 在发酵过程中,随着时间的延长,霉菌的产酶量也发生变化。本实验在28℃、自然pH条件下同时培养3种霉菌,分别测定酸性、中性、碱性蛋白酶活力,绘制酶活力随发酵时间变化(24、36、48 、60、72和84h)的曲线,确定产酶量达到高峰的时间。 1.3.4 初始ph的确定 在发酵过程中,初始pH的不同,产酶量也不同。在自然界中,从pH1.0-11.0都有微生物生活,但只有少数种类能在pH2.0以下和pH10.0以上生长。因此本实验对初始pH进行确定,选择范围为pH2.5-10.0。用HCl或NaOH调节培养基的起始pH值,3种霉菌同时在28℃下接种培养2 d后测定酸性、中性、碱性蛋白酶活力。 1.3.5 自然ph对发酵菌种k 本试验所研究的霉菌为嗜温微生物,根据3种霉菌的生长温度范围以及相关的研究,将3种霉菌分别在24、28、32和36℃,自然pH条件下培养2 d后测定酸性、中性、碱性蛋白酶活力。 1.3.6 最适作用ph的测定 在最适温度、pH条件下培养3种霉菌,在达到产酶高峰时取样,提取粗酶液。配制一系列pH范围为3.0-11.0缓冲液,将各霉菌粗酶液适当稀释后,于40℃测定其在不同pH条件下的催化活性,以此确定酶的最适作用pH。 将霉菌粗酶液保存于不同pH的缓冲溶液中,室温下放置10h后,于40℃测定它在相应pH下的残留酶活力,pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。 2 结果与分析 2.13 关于混合酶状况的研究 2.1.1 酸性、中性、碱性蛋白酶活力 测定在不同培养时间下3种霉菌产蛋白酶的活力,可以得到趋势图(图2)。 图2显示了在相同的培养温度(28℃)下,雅致放射毛霉、米曲霉、少孢根霉的产酶曲线,从图中我们可以看到少孢根霉产生酸性蛋白酶的能力较强,在培养到36-48 h时,其酸性蛋白酶活力达到70-8