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枯草芽孢杆菌产淀粉酶菌株的筛选 淀粉酶是碳水化合物和糖原酶的总称。它可以脱水并生成各种脱水产物，包括糊精，并逐渐生成由葡萄糖单位组成的聚合物。微生物的许多种类都能产生淀粉酶, 枯草芽孢杆菌是其中主要生产菌种之一。淀粉酶是最早实现工业化生产, 迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。特别是20世纪60年代以来, 由于酶法生产葡萄糖以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化, 淀粉酶的需要量越来越大, 几乎占到整个酶制剂总产量的50% 。目前淀粉酶被广泛应用于多个领域, 因此, 做好淀粉酶活性测定工作具有重要意义。 测定α-淀粉酶活性的方法有分光光度法、应交扩散法、3, 5-二硝基水杨酸法、黏度计法和降落值法。目前, 3, 5-二硝基水杨酸法是最常用的方法。在大多数测定淀粉酶的实验和标准中, 都是采用常规的方法和步骤, 试剂用量较大, 且操作过程不够简便。本实验选用的产淀粉酶菌株是实验室保存的枯草芽孢杆菌, 经过平板分离、点种、碘熏蒸, 筛选出淀粉产酶活性较高的菌株; 通过常量和微量两种方法分别测定淀粉酶活性, 并对测定结果进行比较分析, 希望可以提供一种能够代替常量测定的经济、有效、简便的方法。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 来源：蘑菇 实验室试管保存的枯草芽孢杆菌。 1.1.2 标糖溶液dmd/l 柠檬酸缓冲液 ( p H 6. 0) , 0. 4 mol/L氢氧化钠溶液, 1% 淀粉溶液, 3, 5-二硝基水杨酸 ( DNS) , 标准葡萄糖溶液 ( 1 g /L) 。 1.1.3 琼脂糖凝胶电泳 斜面培养基: 可溶性淀粉1% , 牛肉膏1% , 蛋白胨1% , 酵母膏0. 2% , 氯化钠0. 5% , 琼脂2% , pH 6. 5。 种子培养基: 葡萄糖5% , 牛肉膏1% , 蛋白胨1. 5% , 酵母膏0. 2% , 氯化钠0. 5% , p H 6. 5。 发酵培养基: 可溶性淀粉5% , 牛肉膏1% , 蛋白胨1. 5% , 酵母膏0. 2% , 氯化钠0. 5% , 氯化钙1% , pH 6. 5。 1.1.4 实验室仪器仪器 722N可见分光光度计, 101A-2电热鼓风干燥箱, 恒温水浴锅, 电热恒温培养箱, YPW-Ⅰ型迴转式恒温调速摇瓶柜, 80-1离心沉淀器, 净化工作台, JA5002电子天平, 蒸汽消毒器, 电炉, 电磁炉等实验室常用仪器。 1.2 实验方法 1.2.1 细菌的筛选和保存 1.2.1. 菌种点种的培养 将试管保存的制备枯草芽孢杆菌成菌悬液, 分别稀释10- 1、10- 2、10- 3、10- 4、10- 5、10- 6、10- 7倍, 各取1 m L涂布于平面上, 分别置于37℃恒温箱中培养。在浓度适当的培养基上选取15个菌株, 分别编号, 转接于试管斜面, 于37℃下培养24 h, 置冰箱保存。然后用接种针分别蘸取每个菌落点种在已经灭过菌的平板上, 37℃下培养24 h。用碘熏蒸培养皿, 在菌落周围出现水解圈, 测量水解圈直径与菌落直径并计算其比值 ( HC比值) , 作为筛选指标。 1.2.1. 2.防疫 选取酶活性较高的菌株, 将冰箱中保存的相应菌株接种于20支试管斜面上, 37℃下培养24 h, 然后保存在4℃冰箱中。 1.2.2 淀粉酶活性的定量和定量测定 1.2.2. 培养条件:1 从冰箱中取出保存的菌株, 转接试管斜面活化, 37℃下恒温培养24 h。将菌种挑取三环接种到30 /250 m L种子培养基中, 37℃ , 160 r / min, 培养12 h。用移液管吸取3 m L接种到30 /250 m L发酵培养基中, 37℃, 160 r/min, 培养48 h。 发酵液3500 r/min离心10 min, 去上清液, 即为粗酶液。 1.2.2. 酶促氧化法ph 每一个样品4支试管, 一个做对照, 其他用于测定样品 ( 3个平行样) ; 每管加入酶液1 m L, 向各管中加入柠檬酸缓冲液 ( p H 6. 0) 1 m L, 然后再向对照管中加入0. 4 mol/L氢氧化钠溶液, 以终止其中的酶促反应, 各管均是在60℃水浴15 min; 分别向各试管中加入60℃水浴预热15 min的1% 淀粉溶液, 摇匀, 立即放回水浴中, 准确保温10 min; 迅速向各测定管中加入0. 4 mol/L氢氧化钠溶液, 以终止酶促反应。每一步加入试剂的用量见表1。 1.2.2. 紫外分光光度法提取酶促反应单因素试验和标准液温度 待测样: 取上述酶促反应液于试管中, 加入3, 5二硝基水杨酸, 沸水浴5 min。取出冷却, 蒸馏水稀释。利用可见分光光度计测定520 nm下的吸光度。其中, 常量试剂中, 酶促反应液和DNS各2. 0 m L, 稀释至24 m L;