多聚酶链反应法检测曼氏血吸虫dna.docxVIP

多聚酶链反应法检测曼氏血吸虫dna 需要在粪便中检测到卵石。kato-katz法是一种经济、易于被广泛使用的诊断方法，但在流行率和感染度较低的地区，这种方法的敏感性较低。此外, 对新感染虫体尚未产卵阶段亦无法检出, 因而存在一定的局限性。作者研究和开发了多聚酶链反应 (PCR) 的诊断技术, 首次从人体粪便与血清中检测曼氏血吸虫DNA。 运用样本抽提技术和二步快速反应来扩增粪便和血清中的曼氏血吸虫的DNA。收集100个曼氏血吸虫尾蚴感染45天的小鼠肝脏中的曼氏血吸虫虫卵, 贮存于-20℃的0.9%盐水中备用。将含有200个虫卵的盐水液10μl加入90μl的水中旋转5 min使卵壳破碎, 毛蚴释出, 用于DNA抽提。其它4种蠕虫 (人蛔虫、十二指肠钩虫、猪带绦虫和鞭虫) 的DNA, 由巴西Belo Horizonte实验室提供。用人工方法把虫卵与粪便相混合。含有216个虫卵的曼氏血吸虫虫卵粪便0.1 g与不含虫卵的粪便0.9 g混合, 使之每克粪虫卵 (EPG) 变为21.6个。然后两次进行10倍稀释, 使EPG分别为2.16, 0.216。这些样本用Kato-Katz法分析, 并贮存于-70℃备用。取100 mg粪稀释于400μl水中, 并旋转振荡, 使卵壳破碎, 毛蚴释出。上清液用于DNA抽提。7例患者粪便来自流行区, EPG为72-912个。用上述方法将虫卵与粪便混合作DNA提取。2例粪便EPG为96-216个的曼氏血吸虫感染者血清及2例实验室人员阴性血清贮存于-20℃, 直接用于DNA抽提。粪便及曼氏血吸虫及有关蠕虫的虫卵DNA用改良ROSE法抽提。从曼氏血吸虫虫卵和其它4种蠕虫卵抽提出的DNA在260 nm、280 nm处用分光光度法定量。按照制造商的提示, 血清游离DNA 100μl用Glass MAX DNA分离系统纯化。用引物扩增由Hamburguer等所描述的曼氏血吸虫121 bp串联重复序列。 作者分析和比较了PCR法及KatoKatz法, 发现5例血吸虫感染者样本用Kato-Katz法仅检出2例, EPG分别为216和48, 而PCR法测出5例均为阳性, 包括1例EPG为2.16者。未感染者粪便PCR法均为阴性。在临床上, PCR能够在每克粪便所含虫卵数不同的情况下检测到曼氏血吸虫DNA, 所有粪检阳性者血清经PCR检测均为阳性, 而阴性对照组血清均为阴性。在人工制备的粪检曼氏血吸虫虫卵阳性的样本中, PCR能检测到Kato-Katz法所检测不到的曼氏血吸虫DNA, 而上述4种蠕虫感染用PCR法检测均为阴性。 根据初步结果, 作者认为, PCR是比Kato-Katz法及循环抗原检测具有更高敏感性和特异性的诊断曼氏血吸虫感染的方法。此法在流行病学与临床检测中应用价值的研究正在进行中。