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电针通过关元穴传递大鼠伪狂犬病毒的机制研究 自古以来，关元穴一直是中医治疗女性生殖系统疾病的重要穴位。临床上，以关元穴为主的针灸团体治疗闭经综合征，取得了良好的治疗效果。我们课题组在以往开展的“针刺调整女性生殖功能异常的机制研究”中观察到:下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)超常释放,垂体激素促黄体激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)分泌增多,外周雌激素水平明显降低;在给予以“关元”穴为主的一组穴位针刺处理后,下丘脑视前区β-内啡肽、多巴胺释放增加,抑制性氨基酸递质γ-氨基丁酸以及催乳素释放肽也增加,与此同时,GnRH的超常分泌受到抑制,动物外周血雌二醇水平升高,垂体LH含量明显降低。然而,针刺的穴位在下腹部,女性生殖内分泌的调节中枢却位于下丘脑,针刺信号是如何由下腹部的穴位区传递到下丘脑,从而引起众多神经递质、神经肽的改变?其机制至今尚不清楚。我们在前期工作中应用霍乱毒素B 亚单位-辣根过氧化物酶(CB-HRP)示踪法对大鼠“关元” 穴传入的神经节段分布进行了研究,发现在大鼠的T11-L3双侧背根神经节中都存在与“关元”穴相关的CB-HRP标记细胞,电针组的标记细胞总数显著高于对照组,说明针刺穴位信号传导途径与神经通路密切相关。但由于该示踪方法的局限性,未能对针刺信号的传导进行进一步示踪。本实验利用嗜神经病毒跨突触传递的特性,进一步研究 “关元”穴针刺信号在中枢神经内的传导通路,为“关元”穴针刺信号传入神经中枢提供形态学依据。 1 材料和方法 1.1 阴道缺失细胞的诱导切除 雌性Sprague-Dawley大鼠24只,45日龄左右,180～200 g,购自复旦大学实验动物中心。饲养于 12 h 光照/12 h 黑暗的环境中,自由摄食和饮水。经阴道涂片选取阴道脱落细胞存在典型的 4 d 周期性变化者,在实验环境中适应1周后进行实验。动物的处理符合实验动物使用准则,并通过伦理委员会审批。动物随机分为正常组(NC)、正常加电针组(NC+EA)、去卵巢组(OVX)和去卵巢加电针组(OVX+EA),每组6只。OVX和OVX+EA组在乙醚麻醉下做双侧卵巢切除术,术后3周,连续 4 d 阴道涂片找不到脱落上皮细胞作为卵巢切除完整的指标。相同条件下喂养4周,NC+EA和OVX+EA组给予电针处理。第3次电针处理结束后 6 h,各组大鼠同时处死。 1.2 病毒培养、鉴定与计量 本实验中采用的PRV为PRV-gG--LacZ+株型(由华中农业大学提供),即在野生株型的基础上缺失gG基因,然后插入LacZ标记基因,该病毒可以在大鼠体内同时进行顺行和逆行传递。病毒悬液保存在 -80 ℃ 条件下,直到病毒传代、滴度测定或注射。病毒传代与滴度测定时采用猪肾细胞PK15。首先将适量病毒悬液加入长满单层细胞的细胞瓶内,使其覆盖细胞单层,在培养箱中培养 45～60 min 后,加入维持液继续培养直到75%以上细胞出现病变时,收集病毒,分置于容器内低温保存。病毒滴度测定在6孔板进行,首先将稀释不同倍数的病毒悬液加入长满单层PK15细胞的6孔板内,然后再覆盖一层与小牛血清混合的琼脂糖。当出现适量空斑后,中性红染色进行计数。噬斑形成单位(PFU)的计算方法:空斑数×病毒稀释倍数/接种病毒体积。PRV仅注射1次,用微量注射器将 10 μl (108PFU/ml)的PRV缓慢注入“关元”穴(速度为 1 μl/min),注射完毕后留针 10 min。 1.3 第1次电针处理 NC+EA 和OVX+EA组分别在注射病毒后 30 min,在“关元”穴给予第1次电针处理,连续 3 d,1次/d,每次 30 min,在上午8～12点间完成。采用连续波,刺激频率为 2 Hz,强度为 2～3 mA (韩氏电针仪,北京华卫产业开发公司生产),以动物下肢发生轻度抖动为度。 1.4 动物肢体灌注 大鼠在7%水合氯醛(1 ml/ 200 g)麻醉下,迅速打开胸腔,暴露心脏,经左心室插管至升主动脉,剪开右心耳,快速灌入预冷的生理盐水 300 ml 冲洗,随后用 200 ml 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(PB) 配制的4%中性多聚甲醛(pH 7.4) 快速固定,当动物肢体伸展后减慢灌注速度,约 30 min 内灌注完毕。在背部从上到下依次钳断大鼠颅骨和脊椎骨,取出大脑和脊髓,放入含20%蔗糖的4%多聚甲醛液中固定 24 h,待组织完全下沉后,浸入30%蔗糖磷酸缓冲液中。分离脑和脊髓,将其制成 35 μm 厚的冠状位连续冰冻切片(CM-1900恒冷切片机),分别放在不同标记的24孔板中。 1.5 羊抗兔二抗prv观察总体规划 将切片在兔抗大鼠β-半乳糖苷酶多克隆抗体(英国ABCam公司,工作浓度1∶5 000) 溶液中,37 ℃ 孵育 2 h, 4 ℃ 放置 24～48 h,然后用羊抗兔二