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荧光原位杂交技术在微生物群落研究中的应用 在许多微生物生态学、微生物诊断和环境微生物的领域，需要一种快速、特异性的检测方法。但是常规的培养基培养方法通常费时费力,尤其对于选择性高、营养需求复杂或目前为止无法培养的微生物种类,无法实现快速的培养和有效的检测。基于此,近年来国内外诸多学者先后开展了分子生物学方法的建立及生物学评价工作,从而更快、更精确地揭示微生物的种类和多样性。目前常用的分子生物学方法包括基于PCR的核酸技术(PCR-RFLP, PCR-SSCP, PCR-DGGE, RT-PCR等),DNA直接测序等。然而这些方法无法提供微生物形态学、空间分布和生物体的细胞环境等信息,并且PCR对环境样品分析存在一定的偏差。荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)技术结合分子生物学的精确性和显微镜的可视性,可进行微生物的空间分布情况分析和特征性微生物的鉴定与定量分析。1989年,DeLong首次将荧光标记寡核苷 酸探针应用于检测单个微生物细胞,开创了应用于微生物生态学的先河。由于该法操作容易、安全、检测迅速,目前已广泛应用于环境微生物生态学和食品学等领域,成为研究微生物群落最具生命力的技术之一。 1 荧光原位杂交 荧光原位杂交技术由原位杂交技术(In situ Hybridization, ISH)发展而来,其间经历了放射性标记探针和荧光标记探针 2 个阶段。最近10 a,荧光原位杂交技术已成为鉴定环境微生物的一个标准方法。 荧光原位杂交技术的原理是dsDNA变性后和带有互补序列的同源单链退火配对形成双链结构的过程。退火复性形成的可以是双链DNA或DNA/RNA异质双链分子,带有荧光标记的探针与固定在玻片或纤维膜上的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交,探测其中所有的同源核酸序列,结果可直接在共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜下观察,无需单独分离DNA或RNA。此技术包括如下步骤:样品固定、样品的制备与预处理、预杂交、探针和样品的变性、杂交、漂洗和检测信号等。下面简要介绍FISH技术中的 4 个关键环节:探针与标记、荧光染料、FISH的靶序列、杂交。 1.1 荧光标记法 FISH所采用的探针必须具有特异性强,灵敏度高,良好的组织渗透性。一个典型的寡核苷酸探针长度一般是 15~30 bp。标记的方法一般有以下几种:①直接荧光标记,通过荧光素与探针核苷或磷酸戊糖骨架共价结合,或是掺入荧光素-核苷三磷酸,一个或更多荧光素分子直接结合到寡核苷酸上,在杂交以后直接检测荧光信号。它是使用最普遍,最简单,最快,最便宜的标记方法;②间接荧光标记,是指将标记物(如地高辛、生物素)连接到探针上,然后利用偶联有荧光染料的亲和素或抗体进行检测的方法。荧光素-异硫氰酸(FITC)通过18-C间隔物偶联到寡核苷酸与直接连接到探针上相比可以增加荧光信号。 1.2 背景染料的检测 由于不同的荧光染料通常具有不同的激发和散射波长,因此可以同时观察两种或更多的微生物。为了清晰地同时观察两种以上的微生物,就需要多波峰的滤镜及要求荧光染料具备狭窄的散射峰,以免探针之间光谱的重叠。常用的荧光染料有荧光素衍生物(FITC、FluoX)、罗丹明衍生物(TRITC、Texas Red)和吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)等,而吲哚二羧菁与前者相比具有亮度高和光熄灭稳定性。背景染料可以用DAPI,来界定生物体的细胞区域。Davenport等用TRITC标记mycolata菌种探针和用FITC标记细菌通用探针,从而来定量每毫升样品中mycolata细胞数量。Liao等用Cy3标记的S- S-S.nat-0656-a-A-18探针进行杂交,在显微镜下,S.natans细胞显红色,把DAPI作为背景染料,使所有的细胞显蓝色,从而对接种于完全混合反应器中一天后的S.natans细胞进行定量。 1.3 种属鉴定和定量鉴定 在微生物学的研究中通常使用的靶序列是16S rRNA,这是由于细胞体内核糖体RNA(rRNA)量的丰富性,且具有特异区和高度保守区。因此可以根据rRNA目标区域设计探针,进行种属的特征性鉴定。近年来,还出现了应用核酸肽(PNA)探针的FISH技术对特征性微生物进行鉴定和定量的研究。Lehtola等应用PNA-FISH技术直接检测和鉴定生活用水过滤膜上的M.Avium和subsp.Avium。 1.4 fish的制备 在保持细胞形态的条件下,进行细胞内的杂交与显色来分析DNA或RNA。包括以下步骤:①细胞的固定与处理:有效的细胞固定对于获得满意的FISH结果是至关重要的,而预处理就是要增加细胞组织的渗透性以及减少非特异性目标序列的结合。一般采用4%多聚甲醛固定,用蛋白酶K或HCl预处理;②杂交:这是FISH技术操作过程的核心