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产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的检测研究进展 作为一个由水和土壤相互作用形成的独特生态系统，自然湿地只占地球表面的小部分，而是烷（ch4）的重要来源之一。预计每年释放约100-231g，这对全球气候变化有很大影响。在自然湿地土壤中,产甲烷菌和其他细菌形成一种特殊的互营关系,持续降解生物质并接受末端电子产生甲烷;而相当一部分甲烷在从土壤和水体释放到大气之前,被甲烷氧化菌重新吸收利用。因此,产甲烷菌和甲烷氧化菌是介导自然湿地甲烷循环的重要功能菌群。探索自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌的多样性有助于深入认知自然湿地甲烷代谢循环的微生物学机制,为人类最终有效调控湿地甲烷代谢,减少甲烷排放通量提供科学基础。 自然环境中微生物群落极其复杂,传统依赖于培养的方法已被证实无法充分描述微生物的多样性,可能会错失99%以上的微生物种类。分子生态学方法的应用,有效地克服了传统分析检测方法的不足,提高了分析检测的速度及结果的准确度和完整性,从分子水平上较为客观地揭示了微生物的多样性。近10多年来,分子生态学方法已成为自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性研究的关键手段,并取得了丰硕的成果。我国也已在青藏高原若尔盖湿地开展了产甲烷菌和甲烷氧化菌的一些相关研究。本文对自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌的定性和定量分子检测方法,特别是标记基因以及不同类型自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌群落多样性的最新研究进展进行了综述,并提出今后我国应重点给予关注的一些问题和研究方向,旨在促进我国在该领域开展系统、深入的研究,填补相应空白。 1 标记基因的选择 标记基因是一种已知序列或已知功能的基因,能够起着特异性标记的作用,因此可用来标记具有特定遗传特征的微生物。选择一个合适的标记基因是微生物多样性分子检测中面临的首要问题。16S rRNA基因携带大量可用于设计引物的序列信息,是目前应用最广泛的标记基因;而功能基因则可标记具有特定生理和代谢功能的微生物,也是多样性分子检测中一类重要的标记基因。 1.11 自然湿地中产甲烷菌多样性的检测 Woese等通过对核糖体RNA(rRNA)序列的比对分析,完美定义了生命的三域,强调了rRNA作为系统发育标记基因的重要性。16S rRNA分子存在于所有的细胞生命形式中,它包含高度保守的区域,并穿插着许多可变区域。可变区域允许序列的比对,而保守区域则被认为是古菌、细菌和真核生物的特征序列,可用于设计各种引物或探针,使序列的扩增或鉴定达到种的水平。在3种rRNA(5S,16S/18S和23S/28S)类型中,16S rRNA已成为应用最为广泛的标记基因。 许多研究以16S rRNA基因作为标记基因,对自然湿地中产甲烷菌的多样性进行了表征。可特异性扩增产甲烷菌16S rRNA基因的一些引物对(如146f/1324r、0357F/0691R)已被设计出来(表1),并成功应用于自然湿地中产甲烷菌多样性的检测。但是,Banning等研究发现,这些引物也扩增了广古菌门(Euryarchaeota)和泉古菌门(Crenarchaeota)中不产甲烷的古菌,为了消除非特异性扩增,他们设计了3对引物,覆盖许多已知产甲烷菌16S rDNA序列的多样性。此外,产甲烷菌更直接的检测方法是采用古菌的通用引物(如A109f/A912rt、A109f/ A934r等)进行16S rRNA基因的扩增,并通过系统发育分析进行产甲烷菌的分类鉴定(表1)。 自然湿地中甲烷氧化菌的多样性检测同样也可用16S rRNA基因作为标记基因进行表征。最早用来检测甲烷氧化菌的16S rRNA基因探针是9α和10γ,分别靶标丝氨酸途径(Serine pathway)和核酮糖单磷酸盐途径(RuMP pathway)的甲基营养细菌,但这些探针最大缺点是只能靶标甲基营养细菌而不是特定类群的甲烷氧化菌。Holmes等设计了第一对属特异性的引物(Mb1007、 Mc1005、 Mm1007和 Ms1020),分别靶标甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)和甲基弯曲菌属(Methylosinus)的甲烷氧化菌。最近,Chen 等也设计了分别靶标Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌的新引物,这些引物可扩增几乎所有已知甲烷氧化菌的16S rRNA基因,包括甲基热菌属(Methylocaldum)、甲 基 球 形 属(Methylosphaera)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)的甲烷氧化菌,而先前的引物则不扩增这些属的甲烷氧化菌。目前,靶标特定甲烷氧化菌16S rRNA基因的探针或引物只有少数被用于自然湿地环境中,但这些探针及引物是将来开展相关研究很有用的资源(表2)。 1.2 引物的筛选及其