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microrna的定量检测与表达分析 1 mirna在生物探针中的应用 mirna是一个非编码的小分子rna，由18-24个碱性基团组成，广泛存在于人类和大多数生物细胞中。基因组中miRNA基因首先转录形成长链的Pri-miRNA;经Dorsha酶切,形成约70个碱基茎-环结构的前体miRNA(Pre-miRNA),并由Exportin-5蛋白质转运至细胞质;Pre-miRNA再由Dicer酶切而形成成熟miRNA。虽然miRNA早在1993年就被发现,但其功能却是在最近几年才被认识。这些小分子RNA通过碱基配对与信使RNA(mRNA)序列的3′UTR区或编码区结合从而调控靶基因的表达,在动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、代谢等生命活动过程中发挥重要的调控作用。至今已发现了3 000多种不同的miRNA分子,人类细胞中也发现了721种miRNA(miRBase数据库14.0版),目前认为人类约30%的编码基因受到miRNA分子调节。最近的研究表明,miRNA的表达水平与人类重大疾病如癌症等密切相关。这使miRNA可以作为新的生物标志物用于癌症等重大疾病的早期诊断并可作为新的基因药物作用靶点。 由于miRNA序列短、在细胞内的表达水平比较低,而且许多同源miRNA(如let-7家族)序列相似度高,仅差1—2个碱基,使设计的分析探针与miRNA杂交的效率低。所以,miRNA的研究给分析化学在检测的灵敏度和选择性方面都提出了新的挑战。当前,miRNA的检测方法主要有Northern印迹、微阵列芯片、聚合酶链式反应(PCR)扩增和原位杂交等。这些方法多根据生物学上核酸杂交的原理,结合分离技术、扩增技术和标记探针技术等实现miRNA的分析检测。这些方法在miRNA分析研究中各有优缺点,一般分别侧重miRNA定性表征或定量检测的某一方面。近年来,为了提高miRNA检测的灵敏度,多种DNA扩增技术如恒温滚环扩增技术等相继被应用于miRNA分析;为了提高miRNA的检测通量,相继开发了多种微阵列芯片、多种探针标记技术以及检测新方法。此外,一些新材料如共轭聚合物的应用,也为简便快速、高效地检测miRNA提供了新思路。本文综述了miRNA检测方法的研究进展,并评述了各类方法的优缺点。 2 mirna表达检测 从miRNA的发现到现在miRNA的研究,Northern印迹技术一直被应用于miRNA的鉴定和新miRNA的发现。该方法一般是先用聚丙烯酰胺电泳(PAGE)分离出总RNA中长度约200 bp以内的小RNA,然后转移至印迹膜上与标记的寡核苷酸探针杂交,经洗膜、显影后对条带进行分析。标记探针有放射性同位素标记和生物素或地高辛等非同位素标记。结合使用RNA marker可实现miRNA的半定量分析。虽然Northern印迹是当前miRNA分析的标准方法,但其缺点是操作繁琐、耗时长、灵敏度低,分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤,且对RNase污染非常敏感,实验中每一步操作不当都会影响分析结果。 Lau等首先发现了lin-4和let-7两大家族miRNA,应用Northern印迹技术分析研究了线虫miRNA在不同器官中的表达情况。Sempere等利用Northern印迹技术结合α-32P-dATP放射性同位素标记,研究了果蝇体内蜕皮激素含量对let-7表达的影响。 为了提高杂交反应的亲合性和检测灵敏度,锁核酸(locked nucleic acid,LNA)探针被应用于miRNA的分析研究。LNA是一种双环结构的核酸类似物,其核糖骨架上的呋喃环通过2′-O,4′-C糖苷键被锁定在C3′-endo构型。实验表明,在寡核苷酸探针中每引入1个LNA修饰碱基,其与相应的DNA杂交时,解链温度会提高1—8℃,而在与RNA杂交时解链温度会提高2—10℃,从而提高LNA探针与miRNA分子的杂交特异性和灵敏度。Valoczi等提出了LNA修饰探针-Northern印迹分析法,详细研究了LNA修饰碱基的位置、分布和数量对LNA探针-miRNA杂交体稳定性的影响,结果表明,利用LNA3修饰核苷方式,即每隔两个碱基,第三个碱基被LNA修饰时,方法灵敏度比普通Northern印迹法高10倍,特异性也明显提高。 为了简化Northern印迹实验步骤、缩短分析时间和提高检测的灵敏度,Maroney等改进了传统Northern印迹方法,开发利用夹板连接(splinted ligation)同位素探针检测miRNA。方法原理是先设计一个桥式寡聚核苷酸(bridge oligonucleotide)探针,其3′端序列与待测的miRNA完全互补,其5′端序列(14 nt)与设计的一条5′端32P修饰的核酸探针完全互补。然后加入T4 DNA连接酶使miRNA的3′端与32P修饰探