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三七总皂苷对高糖诱导糖尿病肾病大鼠gf- 糖尿病性胃炎（dn）是糖尿病常见和严重的长期并发症之一，也是糖尿病的主要原因之一。中医药治疗DN具有独特的优势,创新中药开发及其作用机制研究成为了目前的研究热点。三七具有化瘀止血、活血定痛、补虚强壮的效,其主要活性成分为三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)。课题组前期创新性地研究发现PNS能够改善阿霉素肾病肾纤维化,PNS单体能够降低TGF-β1m RNA表达而延缓DN肾纤维化。根据中医异病同治理论,不同器官纤维化虽然是相对独立的疾病,但发病的某一阶段的基本病理改变是相同的,可以采用相同的治疗方法。在此基础上,本研究进一步将PNS作用于单侧肾切除后一次性腹腔注射STZ大鼠DN模型,探讨PNS对DN的防治作用机制。 材料和方法 1. 材料表面 1.1 实验动物、饲料 纯系SD大鼠44只(购自北京维通利华动物实验中心,合格证号:SCXR京2006-009),雄性,7周龄,体质量220-230g。适应性喂养1周,自由饮水,进食普通饲料;大鼠肾小球足细胞,由美国维恩大学医学部张玉祥教授馈赠。 1.2 准字点材料 PNS:广西梧州制药(集团)股份有限公司,批准文号:国药准字厄贝沙坦(IRB):购自杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司,批准文号:国药准字STZ:北京市博爱港商贸有限公司,批号:S-0130。 1.3 细胞培养和pcr检测 光学显微镜(Olympus,L340099);图像分析仪(LEICA Q500IW);全自动生化分析仪(Olympus AU400);RT-PCR电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司,JY-SPA);紫外/可见分光光度计(日本UY-2000型);凝胶成像系统(Pharmacia Biotech);细胞培养箱(Heraeus type B5060 EK/CO2,德国);TGF-β1一抗(北京博奥森生物技术有限公司,bs-0103R);Caspase-3一抗(北京博奥森生物技术有限公司,bs-0081R);免疫组化SABC二抗试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司,SP0023);TGF-β1原位杂交试剂盒(天津灏洋,探针序列:5,-GGT GAT TCT CTT GTA GTT CTC CAG CCG AC-3,);足细胞培养液:RPMI 1640培养基90m L,PBS 10m L,104U/m L青霉素/链霉素1.0m L,103U/μLγ-干扰素1.0μL,调p H值至7.2,4℃保存;胎牛血清(杭州四季青);TGF-β1因子(北京康为世纪生物科技有限公司);RT试剂盒(Fermentas公司Revert Aid TMFirst Strand c DNA Synthesis Kit,K1622);PCR试剂盒(2×Taq Master Mix,北京康为世纪生物科技有限公司);RT-PCR引物序列:GAPDH,FW:CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG,RV:GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G,496bp;Caspase-3,FW:ATG GAC AAC AAC GAA ACC TCC GTG,RV:CCA CTC CCA GTC ATT CCT TTA GTG,786bp。 2. 方法 2.1 糖尿病模型的制备 按体质量随机分出正常组10只,剩下大鼠采用单侧肾切除加一次性腹腔注射STZ造模。用10%水合氯醛将大鼠麻醉后(0.4m L/100g)切除右肾,逐层缝合皮肤,术后恢复一周,按照55mg/kg一次性腹腔注射STZ,72h后随机血糖≥16.7mmol/L,尿糖4+以上者为糖尿病造模成功。造模后按体质量随机分组:模型组11只,厄贝沙坦组11只(17.5mg/kg灌胃),PNS组11只(17.5mg/kg腹腔注射)。模型组和正常组每日给予等容积蒸馏水灌胃,共12周。 2.2 各组含药血清糖、糖、tgf-1、pns的血清见表1 大鼠肾小球足细胞复苏,于25cm2细胞培养瓶内加入5m L含5%胎牛血清足细胞培养液,置于33℃、5%CO2细胞培养箱内传代培养。细胞分组:正常组:正常组血清6.7%;高糖组:模型组血清6.7%+葡萄糖4.5%;TGF-β1组:正常组血清6.7%+葡萄糖4.5%+TGF-β150nmo L;IRB组:IRB含药血清6.7%+葡萄糖4.5%+TGF-β150nmo L;PNS组:PNS含药血清6.7%+葡萄糖4.5%+TGF-β150nmo L。于实验前用将处于对数生长期的各组足细胞用无血清足细胞培养液同步24h,然后按细胞分组加入含有含药血清或和葡萄糖足细胞培养液孵育36h,按试剂盒说明提取每组足细胞总RNA,待测Cas