不同碳源好氧颗粒污泥的微生物种群及微生物形态分析.docxVIP

不同碳源好氧颗粒污泥的微生物种群及微生物形态分析 好氧污泥（ags）作为一种自固定的微生物收集体，具有良好的沉淀性能、高污泥量和抗冲击负荷等显著优点。由于ags的结构特征和溶解氧的传质限制，硝化菌、反硝化菌和聚磷菌可在ags中形成相互交织、共同生长的微生态系统，为单个月内高效的单级sdr实现同步脱氮和去除磷的提供方便[1.4]。 胞外多聚物(extracellular polymeric substances,EPS)是微生物聚集体(如活性污泥絮凝体、生物膜、颗粒污泥等)的重要组成部分,主要包括多糖、蛋白质、核酸、脂类和腐殖酸等成分.研究者使用特异性荧光染色剂、三位荧光光谱、SDS、钌红染色-TEM等技术对EPS的组成、分布及其与AGS的形成、稳定性的关系进行了探讨.但是结合荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)和多重荧光染色技术系统全面共同研究EPS和功能菌群对常低温同步脱氮除磷AGS的形成和稳定维持的影响鲜见报道. 本试验以处理实际生活污水实现常低温稳定同步脱氮除磷的AGS为研究对象,利用FISH技术研究AGS中全菌、氨氧化菌、聚磷菌的相对数量、空间分布及其与AGS同步脱氮除磷的关系;同时采用多重荧光染色技术研究AGS胞外蛋白、α-吡喃葡萄糖、α-甘露糖和β-D-吡喃葡萄糖、脂类;凋亡(活菌、死菌)的相对数量和空间分布;并结合SEM共同探讨同步脱氮除磷AGS形成和稳定维持的机制以及生化反应机制. 1 材料和方法 1.1 ags的建立和运行 试验所用污泥来源于北京市方庄污水处理厂排放的剩余污泥;试验用水为北京工业大学家属区排放的实际生活污水,其水质平均值COD为191.37mg/L,PO43--P为6.14 mg/L,NH4+-N为58.32 mg/L,p H为7.4.在直径D=180 mm,有效高度H=550mm,有效容积为12 L的2个SBR反应器(命名为A、B)内培养AGS,曝气量为0.16 m3/h,初始MLSS为2 600 mg/L左右,反应器共运行254 d,第1~165d为夏秋季,水温为18~27℃,第166~254 d为冬季,水温最低可达9~13℃.由于原水有机物含量过低,从第42 d向A中添加丙酸钠+乙酸钠,B中添加葡萄糖,设计COD∶N∶P均约为360∶60∶6.反应器的运行方式为进水(2 min),厌氧(238 min),曝气(470 min),沉淀(1~5 min),排水(2 min),采用时间程序控制器自动控制各反应段的开关.AGS形成并稳定之后,粒径分布在0.3~1.0 mm的范围内.系统以厌氧/好氧的简单运行方式能够实现稳定的同步脱氮除磷效果,常温4个月以及低温效果恢复之后分别稳定运行56 d、42 d内,出水NH4+-N、TIN和PO43--P均能达到GB 18918-2002一级排放标准.本试验取用AGS样本为低温稳定运行时期的A、B 2个反应器的AGS. 1.2 荧光原位杂交 将A、B中培养获得的AGS用现配的4%多聚甲醛溶液在4℃固定6~12 h,保存在-20℃的PBS+乙醇(1∶1)溶液中;再用蔗糖溶液、OCT包埋剂对样品分别进行脱水和包埋,之后用冷冻切片机(Leica CM 1850,德国)对样品进行切片(切片厚度一般为10~20μm);将切片粘在明胶包被过的载玻片上,空气中干燥后先后浸泡于50%、80%和98%的乙醇溶液中脱水3 min.按照标准杂交程序进行荧光原位杂交,所用探针(大连Ta Ka Ra)见表1,荧光染料位置均在5′端,一次探针用量为10μL.杂交完毕后使用荧光显微镜(OLYMPUS BX52)或激光共聚焦显微镜(OLYMPUS,FV1000)对样品进行观察拍照,每个污泥样品随机拍摄20~25张照片,用Image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics Inc.)进行定量分析. EUBm ix由EUB338、EUB338-Ⅱ、EUB338-Ⅲ按体积比1∶1∶1混合组成.PAOm ix为PAO462、PAO651和PAO846按照体积比1∶1∶1混合而成.EUBm ix针对全菌;NSO190和NSO1225针对氨氧化菌、PAOm ix针对聚磷菌. 1.3 相关理化性质研究 首先用甲醛+氢氧化钠法对2个反应器中AGS的EPS进行提取,并使用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、二苯胺比色法分别对EPS中的多糖、蛋白质以及核酸进行化学定量分析,详见参考文献. 1.3.1 胞膜荧光染料 为了对AGS中的活细菌和死细菌进行相对定量和空间分布定位,使用Hoechst 33342和PI进行双重荧光染色.Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料,对细胞的毒性较低,可以用来染活细胞.PI则是一