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microrna检测方法的研究进展 微型钠是一种非编码的小型钠，由22.23个果糖苷组成。miRNA通常来源于一个大小约为1 000 bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA),Pri-miRNA分子在细胞核中经过双链RNA特异性RNaseⅢ-Drosha的作用下形成70~100 nt的具有茎环结构的RNA分子(Pre-miRNA)。Pre-miRNA在exportin-5的作用下转运至胞质中,被另一个双链RNA特异性RNaseⅢ-Dicer识别,被进一步切割成长约22 nt的小分子RNA,即成熟的miRNA。成熟的miRNA在RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)引导下与互补mRNA完全或不完全配对,降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译。已证明,miRNA能够调控多种生理学和病理学的过程,如细胞分化、细胞增殖和肿瘤形成。 目前已经鉴定出几百个人类miRNAs,并且发现它们的序列高度保守;再加上通过计算方法分析推测出的miRNAs,其数量已在1 000以上,但目前仍然很难估计人类和其它哺乳类动物中到底有多少 miRNAs。据推测1个miRNA有几百个靶基因,这就意味着miRNA调控着一半以上的人类蛋白的编码基因。最近,miRNA对肿瘤的影响逐渐受到重视。毋庸置疑,在对miRNA进行研究之前需要首先对其进行检测鉴定,但由于miRNAs序列很短、家族成员序列类似且存在多种成熟形式,对其进行检测甚至定量均是一种挑战。那么如何检测miRNAs呢,本综述综合目前的研究现状,介绍几种检测miRNAs的方法。 1 胞基因表达的一般方法 RNA印迹即Northern blot是最经典的检测真核生物RNA的量和大小及估计其丰度的实验方法,可以从大量的RNA样本中同时获得这些信息,这是其它实验方法所无法比拟的。Northern blot是研究真核细胞基因表达的基本方法,自1977年Alwine等报道以后,1979年就成了分子生物学基本操作方法的一部分。以后,虽做过多次变动和改进,但基本步骤没有改变。主要包括:①完整的RNA的分离;②根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离;③将RNA转移到固相支持物上,在转移过程中,要保持RNA在凝胶中的相对分布;④将RNA固定到固体支持物上;⑤固相RNA与探针分子杂交;⑥除去非特异结合到固相支持物上的探针分子;⑦对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。Northern blot是检测miRNAs的标准方法,并常用来评价其它的miRNAs检测方法的可靠性。RNA杂交的缺点是低通量,并且在检测稀有miRNAs时灵敏度不够。 2 实时rt-pcr方法检测mrna 实时PCR(Real time PCR, RT-PCR)有时也称为动力学PCR,用于基因表达的定量和用DNA陈列技术检测证实基因的差异表达。实时PCR可用已经商品化的荧光检测PCR仪同时进行扩增特异性核酸序列和测定其浓度,不必在PCR扩增反应过程中抽取样品进行检测。荧光检测PCR仪可对于整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化图。在反应混合液中靶序列的起始浓度越大,要求获得扩增产物的特定产量的PCR循环数越少。因此,靶序列的起始浓度能够用要求获得扩增产物的一种特定阈值的PCR循环数(CT)来表达。以CT为横坐标,以一套标准DNA分子产量的起始拷贝数的以10为底的对数值为纵坐标作半对数图,呈一条直线。一种未知样品的靶序列可以通过对照这种标准曲线的内推法定量。Bandres等报道用real time PCR检测肿瘤组织与非瘤组织中miRNAs表达,发现两者间的表达量存在差异。在real time PCR的基础上,Lao等报道通过区分RT引物和合成第二条链的引物,可以用多元的RT-PCR扩增很少量的样本中的miRNAs并分别定量各个miRNA。该方法提高了反应的特异性,并且可以把所有的miRNAs纳入单个的多元RT-PCR反应体系中。实时PCR最大的缺点是价格昂贵,不仅购买整套的机器系统价格昂贵,其维持和运行费用也相当可观,普通实验室难以开展此项目,使其使用受限。 到目前为止,RT-PCR和Norther blot联合使用,是定量检测miRNAs的经典方法。 3 mirna检测 Liu等用含有245个人类及鼠基因组的探针的微芯片(Microchip)大量筛选miRNA,miRNA microarray可以检测组织特异的miRNA,并且实验结果可重复率高。这种微芯片不仅可以检测miRNA的类型,还可以对其进行定量。它可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达;通过设计适当的寡核苷酸探针,同时检测成熟的miRNA及其前体分子;另外需要样本量小。通过Northern blot和re