dna荧光原位杂交技术的研究进展.docxVIP

dna荧光原位杂交技术的研究进展 21世纪80年代末，以第二面原意义上的异构象——昆虫遗传改良（fish）技术是根据现有的核电站原状位异形象技术发展起来的。目前已广泛应用于动植物基因组结构的研究,分辨复杂的染色体易位、病毒的感染、DNA物理图谱的构建、人类的产前诊断及哺乳动物染色体进化研究领域等许多方面。它与放射性同位素技术相比具有快速、安全、灵敏度高、探针可长期保存等特点。FISH技术与传统的细胞遗传学技术相结合正开创着分子细胞遗传学新天地。 1 探针的标记方法 荧光原位杂交技术的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记,然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。 常用的探针可分三类:①染色体特异重复序列探针(probe to chromosome-specific repeated sequence)。像α卫星、卫星Ⅲ类的探针,他们的杂交靶位常大于1Mb,不含散在重复序列,与靶位结合紧密,杂交信号强,易于检测,常用于监测间期细胞非整倍体和微小标志染色体;②全染色体或染色体区域特异性探针(whole-chromosome or chromosome region-specific probes)。由一条染色体或其上某一区域的极端不同核酸片段组成,可由克隆到噬菌体(phage)和粘质粒(cosmids)上的染色体特异性大片段插入文库制取,且微切文库探针片段小,与邻近区域发生重叠及制片过程中被破坏的可能性小。这类探针可用于中期染色体重组和间期核结构分析;③特异性位置探针(specific-locus probe)。常有一个或几个克隆序列组成,可由cDNA克隆或克隆到大片段插入载体的核酸片段制取,主要用来进行染色体克隆DNA序列定位和检测靶DNA序列拷贝数及结构变化。探针的荧光素标记分为间接标记和直接标记。间接标记是用生物素标记的dUTP(biotin-dUTP)通过缺口平移法标记,杂交后再用藕联有荧光素的抗生物素抗体检测。通过几轮抗生素蛋白-荧光素、生物素化的抗-抗生物素蛋白、抗生物素蛋白-荧光素的一系列处理,可放大被检测信号,监测小至500bp的靶序列。直接标记是通过荧光素直接与探针核苷或磷酸戊糖骨架共价结合、或缺口平移法标记探针时掺入荧光素核苷三磷酸标记探针。直接标记的探针经过简单冲洗就可镜检,省去了间接标记的探针杂交后繁琐的检测步骤,但不能像间接标记的探针那样进行多步骤信号放大,因而不如间接标记的探针灵敏,但靶较大时(数百kb),还是较可靠,且探针标记种数不受高亲合力配基(high-affinity binding parter)能力限制。用激发光谱和吸收光谱不同的荧光素按一定调色方法标记探针,就可同时分析不同探针对应的靶DNA。荧光显微镜常用于FISH信号检测,但随着数字成像技术和共焦显微技术的发展,数字显微镜(digital imaging microscopy)、共焦显微镜(confocal microscopy)越来越多的用于探针图谱、基因工程拷贝数、染色体易位、转移细胞的自动化分析、基因型和表型间的关系,促进对遗传畸变所致生物学改变的深入认识。 2 fish在不同领域的应用 2.1 荧光显微镜观察 FISH技术能快速、精确地确定杂交后探针在染色体上的位置,由于它可以用不同的修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针,再用不同的荧光素分子检测不同层次的探针分子,因此,可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位,直接得到它们的相关位置和顺序。 2.1.1 采用fransz的滴片技术 钟筱波等、zhong等在Arabidopsis、番茄、水稻等多种植物中观察分析后发现减数分裂前期的粗线期染色体(pachytene chromosome)最具进行高分辨率FISH的潜力。这一时期的染色体浓缩度比中期染色体大为降低。钟筱波等以Lycopesicon esculenlumcv VFNT cherry 番茄为材料用Fransz的滴片技术选取端粒区内的端粒重复序列和端粒联接重复序列。生物素标记的Arabidopsis thaliana端粒重复序列探针PAtT4和地高辛标记的番茄端粒联接重复序列TGR1,结果发现PAtT4探针杂交到所有番茄染色体端粒上,TGR1只杂交在24个端粒中的20个,其中第1、2、7条染色体的长臂和第2条染色体的短臂不含TGR1序列。 2.1.2 dna序列结构的杂交 Heng等、Fransz等许多学者先后用植物、动物为材料在DNA纤维(extended DNA fibre)进行FISH,已将分辨率水平提高到与常规分子生物学技术Southern Blot分析的