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一种使用反义rna探针检测动物基因表达的方法斑马鱼高分辨率整胚原位杂交实验方法与流程 整粒原始杂交技术是利用反方向的钠检测技术来检测体内mrna表达的一项技术，在研究遗传因素的时空表达方面发挥着重要作用。其原理如图1所示:在胚胎组织或细胞结构保持不变的情况下,根据碱基互补配对原则,地高辛标记的反义RNA探针与细胞内的m RNA特异性结合,利用免疫组织化学的方法,碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体与杂交的核酸探针特异性结合,然后用碱性磷酸酶的发光底物进行显色。这一过程可将基因在体内的表达信号放大,利用显微镜检测基因的时空表达方式及其表达水平。整胚原位杂交技术已经广泛应用在各种模式动物中。以斑马鱼为例,整胚原位杂交技术主要应用在以下方面:(1)检测基因的时空表达,为研究该基因功能以及基因分类提供线索;(2)在高通量药物筛选或突变体筛选中,特异表达的基因标记可作为筛选的重要依据。 自1969年Gall和Pardue利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达以后,原位杂交的方法就逐渐应用到基因定位的研究中。在后续的应用中,原位杂交的方法不断得以改进并广泛应用。在斑马鱼发展成为一种动物模型后,Westerfield等便用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。同年,Nusslein-Volhard等将Cox建立的RNA原位杂交技术进行了改进,用地高辛标记的RNA在斑马鱼胚胎中检测基因表达。随后,整胚原位杂交技术迅速应用于斑马鱼领域。2008年,Bernard Thisse等将该技术进一步优化,使之更敏感,也提高了基因表达检测的分辨率。 自2009年成立实验室以来,我们一直致力于斑马鱼造血干细胞发育的研究,整胚原位杂交技术成为实验室的一项基本技术,用于检测造血干细胞发育相关调控因子的表达变化。我们参考“The Zebrafish Book”以及Bernard Thisse提供的方法,根据需要加以优化,成功降低了染色背景,提高了敏感度。现将本实验室常规使用的斑马鱼整胚原位杂交的具体实验方法与流程介绍如下。 1 材料表面 1.1 trna相关程序 T7RNA polymerase(Promega,P2075);SP6 RNApolymerase(Promega,P1085);DNase I(NEB,M0303S);Heparin sodium salt(Sigma,H4784);t RNA(RNA from torlua yeast,Type VI,Sigma,R6225);Pronase(Sigma,P6911);Protease K(Amresco,0706);Blocking Reagent(Roche,11096176001);anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments(Roche,11093274910);BM Purple(Roche,11442074001),PFA(Paraformaldehyde,Merck,104005);其余试剂均购自北京化工。 1.2 供试仪器与液制备工艺 LF-杂交炉,ZF-A4原位杂交仪(北京直方,可选)。 10×PBS储液(1L,室温保存):80gNa Cl,2gKCl,27.98gNa2HPO4·12H2O,2.4 gKH2PO4,溶于1L双蒸水。 1×PBST(1L,室温保存):100 mL 10×PBS,1mL Tween 20,用双蒸水定容至1L。 4%PFA(500mL,4℃保存):20 gPFA粉末,溶于500 mL 1×PBS。PFA不易溶解,需要加热搅拌,但加热温度不能高于70℃。 20×SSC储液(pH7.0,1L,室温保存):175.3gNaCl,100.5gC6H5Na3O7·2H2O,溶于1L双蒸水。 2×SSC(200mL,使用前65℃预热):20 mL20×SSC,200μL Tween-20,用双蒸水定容至200mL。 0.2×SSC(500mL,使用前65℃预热):5 mL20×SSC,500μL Tween-20,用双蒸水定容至500mL。 Pronase(Pronase,30 mg/mL,20℃保存):390mg Pronase粉末,溶于13mL缓冲液中,然后置于37℃水浴1h,分装,-20℃保存。使用时,用1×PBS稀释至1 mg/mL,可回收利用2~3次。缓冲液(100 m L):121.1gTris,58.5gNaCl,溶于100mL双蒸水中。 Protease K(-20℃保存):将Protease K按照10mg/mL的浓度,溶于双蒸水中制成储液。使用时,按照1:1000的比例将储液加入1×PBST中,使其终浓度为10μg/mL。 预杂交液Hybe-(1L,室温保存,使用前65℃预热):500mL甲酰胺,250mL 20×SSC,