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免疫共抑制分子pd-1的基因克隆及功能研究 根据t细胞激活的“双信号”模型，t细胞的有效激活和影响功能不仅来自mcl-tr组合的第一信号，还来自具有表面共刺激（apc）的共启动细胞（apc）的第二信号（即辅助信号）。缺乏共刺激的抗原刺激易引发T细胞的无应答、耐受及细胞凋亡。 PD-1最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆,其结构类似于CD28分子。随后的研究表明PD-1的表达与细胞凋亡无关但与淋巴细胞活化相关。PD-1基因敲除小鼠可自发诱导多种自身免疫性疾病,表明PD-1是一种重要的免疫抑制分子并在外周耐受中发挥着重要的作用。因此,以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及诱导器官移植存活等均有重要的意义。现对这一分子的功能及研究进展进行综述。 1 共刺激产物的表达 1992年Ishida等最先从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆到了小鼠的PD-1基因。人PD-1基因位于染色体的2q37.35,为Mr55 000的跨膜糖蛋白,其与小鼠PD-1蛋白在氨基酸组成上有60%的同源性。虽然PD-1被认可为CD28超家族成员,但PD-1蛋白质结构与CD28、CTLA-4及ICOS存在明显差异,具体表现为:(1)PD-1缺乏介导CD28/CT-LA-4与B7.1/B7.2相结合的MYPPPY序列,也缺乏介导ICOS与ICOS-L相结合FDPPPF序列,因此,其与配体的结合非常特异,而不与其他的B7家族分子产生交叉结合。(2)与其他共刺激分子以二聚体形式存在不同,PD-1胞外区缺乏半胱氨酸残基,因此PD-1可以单体的形式存在。 与其他的共刺激分子仅表达于T淋巴细胞不同,PD-1持续性表达于T、B淋巴细胞、骨髓细胞并上调于活化的T细胞表面。因此,PD-1信号主要调节活化及效应期的淋巴细胞功能。PD-1胞内含有两个酪氨酸(小鼠的Y225及Y248,人的Y223及Y248)残基,靠近N端和C端的酪氨酸与临近的氨基酸分别组成ITIM样基序(小鼠的VAYEEL基序及人的VDYGEL基序)及ITSM基序(小鼠及人的都为TEYATI)。当PD-1/BCR或PD-1/TCR交叉连接时,PD-1的ITIM基序可招募胞内的SHP-2并磷酸化Igα、Syk,及其他下游的蛋白,降低BCR或TCR受体信号,最终抑制淋巴细胞的增殖及细胞因子的产生并诱导细胞分裂周期停滞。 2 -h和b7-1、7-2和b7-2对小鼠b7-2和b7h-2的同源性表达 PD-1的两个配体PD-L1及PD-L2已被不同的研究小组鉴定,并分别称为B7-H1及B7-DC。二者都为I型跨膜糖蛋白,属于B7家族成员。其膜外区有免疫球蛋白的V样及C样结构并存在30个氨基酸组成的跨膜区及几个氨基酸的细胞质尾。人B7-H1与B7-1,B7-2及ICOS的同源性约为21至23%。而小鼠的B7-H1与人B7-H1有69%同源性,小鼠B7-H1与B7.1、B7.2及B7h/B7RP-1的同源性约为19%。 与其他的B7家族成员仅表达于造血细胞不同,PD-L1可上调表达于活化的T细胞、B细胞、DC、巨噬细胞、单核细胞,或经IFN-γ刺激的角质细胞、内皮细胞及成肌细胞表面。此外,PD-L1也低水平的表达于非淋巴器官如心脏、胎盘、骨骼肌、肺、肝、脾及胸腺等器官。而PD-L2表达仅局限表达于造血系统来源的细胞如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞并上调表达于活化的T细胞、B细胞及其他组织来源的免疫细胞表面。B7-H1与B7-DC不同的表达方式表明B7-H1在维持外周耐受发挥主要作用而B7-DC主要是在淋巴结的免疫应答中有重要的功能。 3 pd-1和疾病 3.1 pd-1与自身免疫脑脊髓炎 现有的研究表明,PD-1基因敲除小鼠可引发多种自身免疫性疾病。如:C57BL/6基因背景的PD-1基因敲除小鼠发育有狼疮样肾小球肾炎及致死的扩张型心肌病。而B6-PD-1-小鼠与H-2Ld特异的2C-TCR小鼠杂交后产生的H-2b/d小鼠(2C TCR Tg x H2bxdx PD-1-/-)可导致自发的移植物抗宿主疾病。 PD-1的表达也与各种自身免疫性疾病的发生及发展相关。对试验性自身免疫脑脊髓炎(EAE,是一种由自身抗原特异性的T细胞活化诱发的一种自身免疫性疾病)的研究显示,采用髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)免疫EAE小鼠后,其中枢神经系统(CNS)上调表达PD-1及其配体PD-L1,使用PD-1阻断性抗体产生免疫后可导致抗原特异性的T、B细胞繁殖、活化及炎症细胞因子的产生而增强迟发型超敏反应,表明PD-1参与EAE的调节;Ansari等研究表明阻断PD-1/PD-L1信号途径可加速NOD小鼠产生糖尿病,表明增强PD-1共刺激信号有可能在糖尿病的免疫治疗中有重要的应用前景;Prokunina等采用用单核甘