利用纳米技术快速检测食源性致病菌的研究.docVIP

—1— 08024 利用纳米技术 快速检测食源性致病菌的研究 上海市延安中学 高中三年级 黄逸男(个人项目) 二零一零年一月 —2— 利用纳米技术快速检测食源性致病菌的研究 研究论文 一 、 选题目的 单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes,LMO)和 E.coli O157: 是九十年代四大食源性致病菌中重要的两种食源性致病菌。食用了被污染的 LMO 和 E.coliO157, 可引起人和动物患脑膜炎、脑炎、非出血性腹泻等疾病。 发病者死亡率较高， 一般可以达到30～70%。传统的检测方法时间长，需要5~ 7天的时间。现在随着人民生活水平的不断提高，人们对每天食用的食品安全问 题也越来越重视。因此从食品中快速检测这两种致病菌的研究具有十分重要的意 义。 随着现代技术的不断研究，纳米技术已在各行各业中运用，利用纳米技术检 测食源性致病菌解决了迫在眉睫的食源性致病菌快速检测的问题。本研究基于此 目的，利用纳米技术，采用 Immunomagnetic separation/ polymerase chain reaction 即 IMS/PCR 方法，用抗体包被的磁珠，直接从样品中浓缩获取 LMO 和大肠杆 菌0157等食源性致病菌，样品不需要进行富集。可直接利用纳米磁珠富集捕获， 大大节省检测时间。检测时间只需5小时，为食品安全的快速检测及2010年世 博会的食品安全检测技术将起到积极的作用。 二、 国内外的研究概况 随着中国加入 WTO, 我国的食品卫生致病菌检测项目也必将与国际接轨， 单增李氏菌(LMO)、 大肠杆菌0157 等食源性致病菌检验按常规传统检验方法， 要用选择性培养基对样品进行增菌培养，然后划平板分离单菌落，之后再通过一 系列生化实验鉴定。通过以上传统方法，检验周期长，至少需要5～14d 才能得 出结果，步骤烦琐而且检验精度低。 国际上对于食源性致病菌的研究工作进展比较快，世界各国都在研究快速检 出的方法。近几年，国内外研究人员对LMO 和大肠杆菌O157 分离检出作出了 —3— 一些改进。如采用PCR、 酶联荧光免疫VIDAS 方法， API 金标法、 IMS 方法等。 但这些改进方法的前期工作还是需要样品的增菌培养，虽然改进的方法比传统方 法检出时间减少2～3天，但还没有解决快速检出该菌的问题。 虽然有些国外的研究人员利用IMS 和PCR 对 LMO 和大肠杆菌0157进行研 究，但是检测灵敏度很低，检测的时间长，而且样品需要增菌培养后检测。 三、主要研究内容及技术路线 本课题采用先进的 IMS/PCR 方法，利用抗李斯特菌免疫磁性分离技术 anti-Listeria 免疫磁珠和 anti-0157 免疫磁珠，其基本原理是抗原抗体反应。将 包被有抗体的磁珠加到样品中，缓慢振荡，如果样品中含李斯特菌或大肠杆菌 0157,将被吸附在磁珠的抗体上，样品不需要进行富集，可以直接从样品中浓 缩获取LMO 或大肠杆菌O157, 捕获的磁珠再通过消化、抽提细菌的DNA, 参 考国外文献报道，分别用一对 LMO 特异性的溶血素(hlyA)基因和一对 Listeria 23SrRNA 区域特异性的基因；大肠杆菌0157 致病的特征性毒力因子I型志贺毒 素 (stx1)和Ⅱ型志贺毒素 (stx2)、eaeA基因(粘附因子)和hlyA基因(溶血 素基因)分别作为 PCR 的靶基因，其中 stxl 和 stx2 毒素基因较重要。通过复 合PCR 分别得到特异性的700bp 和240bp两个片段和614bp、779bp二条片段中 任意一条，即可认为样品中检出LMO 和大肠杆菌0157致病菌。 本研究采用的 IMS 技术，可最大程度的提高该致病菌的检出率和灵敏度， 采用DNA 抽提及复合PCR 技术，可大大节省检出菌的时间。另外，采用IMS/PCR 联用方法，而最大优点是食源性致病菌检测不需要过夜培养，可以直接利用纳米 磁珠富集捕获，做到少量、快速、经济。在5 小时能够检出 LMO 和大肠杆菌 0157。 本研究基于国外文献报道并结合我国的实际，建立的一种快速检测食品中单 增李斯特菌和大肠杆菌0157的方法，其方法灵敏度高达5CFU/mL, 可在5小时 完成检验，检验结果和传统标准方法一致。 四、实验完成过程 本课题的顺利完成，是在我的辅导教师朱守晨老师、英特尔俱乐部的辅导老 —4— 师及上海市疾病预防控制中心的许学斌老师的帮助下，利用课余及假期时间独立 完成的，在此我对曾经帮助辅导过我的老师表示衷心的感谢。 本课题分以下几个阶段完成： 1.查阅并完成有关方法资料的收集整理，设计实验方案。 2. 查阅文献并设计特异性引物； 3. 确定复合PCR 反应体系的条件； 4. 进行标准菌株