蛋白质的稳定性和稳定化.pptVIP

蛋白质的稳定性和稳定化;第一节: 蛋白质的稳定性;维持蛋白质结构稳定的主要因素:;2蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用;3.盐桥和氢键; ;4.二硫键; 由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低，从而增加蛋白质的稳定性。 与此类似，用双功能试剂实现分子内交联，也能使蛋白质构象稳定化。; 日常生活中的烫发和发型保持， 主要原理是操纵毛发角蛋白二硫键的还原和再氧化， 即二硫键的断开和重新键合。;5.对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低;6.氨基酸残基的坚实装配;7.疏水相互作用;有3个主要因素不利于疏水相互作用： 1.蛋白质球体中的氨基酸必须相当紧密地堆积； 2.影响氨基酸几何形状和能量的微环境； 3.蛋白质多肽链折叠时需要疏水簇仍保持在蛋白质表面，因为在体内，疏水簇负责蛋白质与其他分子的??水相互作用。;二. 测定蛋白质稳定性的方法; 熔化温度Tm和蛋白质伸展50%时的变性剂浓度是预测酶稳定性的最有用参数; 1.Tm: 蛋白质受热伸展过渡中点时的温度; 2.变性剂浓度: 蛋白质加变性剂伸展过程中使蛋白质伸展一半时所需要的变性剂浓度;;第二节：蛋白质失活的原因和机理; 二.聚合作用： 蛋白质发生可逆性伸展 → → 伸展的蛋白质分子彼此缔合 → → 可能发生蛋白质分子间二硫键的形成从而使蛋白质沉淀析出. ;蛋白质的聚合作用和沉淀的区别：; 三、极端pH: 极端pH下引起蛋白质变性的重要因素是：一旦远离了蛋白质的等电点的，那么蛋白质分子内相同电荷间的静电斥力会导致蛋白质伸展。从而使埋藏在蛋白质内部非电离残基发生电离，导致失活。 pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个过程原则上是可逆的,但这些变化常能导致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活.;四、氧化作用: 各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基，从而使蛋白质变性。分子氧、H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。 五、表面活性剂和去污剂 表面活性剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用,导致蛋白质不可逆变性.其中阴离子去污剂的作用比阳离子和非离子去污剂强烈. ;六、变性剂： 1.脲和盐酸胍:机制尚不明确,可能是消除了维持三级结构的疏水作用力或直接与蛋白质分子作用. 2.高浓度盐：高浓度盐既有稳定作用也有变性作用，这要看盐的性质和浓度。 3.螯合：常常不可逆地失活需要金属辅因子的酶，但可稳定不需要金属辅因子的酶； 4.有机溶剂：改变溶液的介电常数;增加疏水核的溶解度,降低带电表面的溶解度;夺去酶分子表面的必需水而使酶失活.;七、重金属离子和巯基试剂: 与蛋白质的巯基、二硫键以及色氨酸、组氨酸残基反应。 八、热: 热失活是工业上最经常遇到的酶失活的原因.热失活分二步过程:伸展---不可逆失活. 九、机械力： 振动、剪切、超声波、压力都可能引起蛋白质的变性。这种变性理论上是可逆的，但也可能伴随着其他反应而不可逆地失活. ; 十、冷冻和脱水： 冷冻和脱水时，溶质被浓缩，引起酶微环境中pH和离子强度的剧烈改变，减弱疏水相互作用,并可能引起二硫交换和巯基的氧化。 十一、辐射作用: 辐射可产生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直接或间接地作用于蛋白质分子. ;第三节 蛋白质的稳定化;一 固定化;一 酶固定到载体上后可产生空间障碍，结果其他大分子难于与酶作用，因此，固定到载体上的酶往往能抵抗蛋白水解酶的降解作用，这也是防止蛋白水解酶自溶的原因 二 底物、配体和氢离子浓度在载体附近和整体溶液之间的分布不均一，造成载体周围的局部浓度与整体浓度不同，也就是酶的微环境发生了变化;三 当酶包埋在多孔颗粒内，底物必须先扩散到颗粒表面（外部质量传递），然后进入颗粒内部（内部质量传递），酶才能与其作用，这些扩散限制可明显使固定化酶“稳定化” 外扩散：底物必须从流动的水溶液传递到固定化酶颗粒外表面 内扩散:底物进一步传递到固定化酶颗粒内部;四 将酶多点共价连接到载体表面，或用双功能试剂交联酶，或将酶包埋在载体紧密的孔中，可以使酶构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡。 A B