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中药复方半夏和颗粒提取物抗五步蛇毒作用研究 半夏是天南星科的一种半夏植物。半夏具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效;临床主要用于镇咳、祛痰、镇吐、抗溃疡、抗心律失常等作用。滴水珠具有解毒消肿、散淤止痛功效;临床用于治疗头痛、神经痛、胃病等疾病。半夏、滴水珠对毒蛇咬伤也具有防治作用,但其抗蛇毒作用目前缺乏系统的研究。本研究对半夏和滴水珠生药以及提取物的抗五步蛇毒中毒作用进行了初步的考察,现将研究结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 真空干燥箱及仪器 (1)仪器。R201旋转式蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司),D180C自动双重纯水蒸馏器(上海申胜生物技术有限公司),AR2130电子精密天平(Ohaus Corp.Pine Brook,NJ,USA),DZG-6050型真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司),SHZ-82恒温振荡器(常州国华电器有限公司),YS-100普通显微镜(NIKON)。(2)试剂。无水乙醇(AR,杭州长征化学试剂有限公司,批号,生理盐水(浙江莎普爱思药业股份有限公司,批号:H 10424-1),纤维蛋白原(FIB)(上海太阳生物技术有限公司,批号:1320351),凝血酶时间(TT)测定试剂盒(凝固法)(上海太阳生物技术有限公司,批号:121080),活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(鞣花酸)(上海太阳生物技术有限公司,批号:1121281),凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(凝固法)(上海太阳生物技术有限公司,批号:103181)。 1.1.2 动物 ICR小鼠72只,体重18～22 g,雌雄各半,由浙江中医药大学实验动物中心提供。 1.1.3 蛇毒 五步蛇为浙江中医药大学生物技术研究所提供;五步蛇毒由本实验室采集,采用低温冷冻干燥法进行提取干燥,呈白色。 1.1.4 保证了办学药学博士丁志山博士的鉴定工作 季德胜蛇药片(南通精华制药股份有限公司,批号:110932),半夏和滴水珠(采自浙江省衢州市江山宝珠农业有限公司,经浙江中医药大学中药学博士丁志山教授鉴定,质量符合相关的规定)。药物的提取:将半夏和滴水珠药材分别打粉,过80目筛,分别取500 g左右,加入2000 ml 95%乙醇回流提取1.5 h,过滤,滤渣再次加入2000 ml 95%乙醇提取,共提取3次,合并3次滤液,减压蒸馏将乙醇蒸干,得半夏和滴水珠醇提物,经真空干燥24 h后密封,阴暗条件下保存。乙醇提取物经碘化铋钾显色呈阳性,表明含生物碱类成分。 1.2 实验方法 1.2.1 给药剂量及给药方式 将ICR小鼠随机分为半夏醇提物组、滴水珠醇提物组、半夏生药组、滴水珠生药组、模型组(五步蛇毒损伤组)、空白对照组以及阳性对照组,其中模型组大鼠为12只,其余组均为10只。半夏醇提物组、滴水珠醇提物组分别给予半夏和滴水珠95%乙醇浸膏2 mg/只(各药物以生理盐水为溶剂,配成混悬液),空白对照组和模型组用相同剂量的生理盐水进行给药,阳性对照组给予季德胜蛇药片30 mg/只,生药组给予对应的生药20 mg/只(研钵中碾碎,用生理盐水配成混悬液)。各组小鼠均以0.2 ml的药物灌胃,连续给药7天,每日给药1次。 1.2.2 大鼠中毒模型的建立 各组小鼠均于末次给药后1 h(除空白对照组外),于腹腔注射五步蛇毒100 μg/只,造成小鼠五步蛇毒中毒模型。 1.2.3 大鼠体重变化的测量 各组小鼠每次给药前以及处死前称取体重,比较各组小鼠的体重变化情况。若注射五步蛇毒后导致小鼠死亡,则于小鼠死亡后立即称取小鼠体重。 1.2.4 大鼠中毒的表现为 造模后,由专人观察并记录各组小鼠的局部症状,以及食欲、呼吸、活动等全身状况,并在注射蛇毒12 h后统计各组小鼠死亡率。 1.2.5 饮料的凝血酶活性测定 小鼠造模后12 h于眼眶取血1 ml,加入0.1 ml 0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝管中,3000 rpm×5 min离心,取血浆,根据血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)试剂盒说明书进行操作,测定相关指标。 1.2.6 红细胞计数wbc (1)红细胞(RBC)计数。小鼠造模后于眼眶取全血10 μl,立即用990 μl红细胞稀释液(NaCl 0.5 g,柠檬酸钠0.25 g,甲醛溶液0.25 ml,加蒸馏水溶解,定容到50 ml)稀释成红细胞混悬液,取10 μl,立即用490 μl红细胞稀释液进行稀释后,在显微镜下用中方格计数的方法进行红细胞计数。(2)白细胞(WBC)计数。小鼠造模后,于眼底静脉丛取血10 μl,用190 μl白细胞稀释液(冰醋酸加水稀释成2% HAc溶液中,然后加入10 g/L结晶紫3滴)稀释,在显微镜下用大方格计数的方