高效液相色谱法同时检测人血浆酮康唑和伏立康唑.docxVIP

高效液相色谱法同时检测人血浆酮康唑和伏立康唑 托吡唑和博尔康唑是临床上常用的抗真菌药物。酮康唑为咪唑类, 伏立康唑是合成的三唑类药物;作用机制为抑制真菌细胞膜麦角甾醇的生物合成, 影响细胞膜的通透性, 抑制其生长。酮康唑用于治疗浅表和深部真菌病, 如皮肤和指甲癣、阴道白念珠菌病、胃肠真菌感染等, 以及由白念珠菌、类球孢子菌、组织胞浆菌等引起的全身感染。伏立康唑用于治疗侵入性曲霉病, 以及对氟康唑耐药的严重侵入性念珠菌感染及由足放线病菌属和镰刀菌属引起的严重真菌感染。 临床应用发现, 伏立康唑的临床效应 (疗效和不良反应) 具有明显的浓度依赖性, 有效治疗浓度范围为0.25～6.00 mg·L-1, 当血药浓度6 mg·L-1时, 肝功能损伤的发生率明显增加。同时发现, 给予相同的剂量, 不同个体的血药浓度差异显著, 即相同剂量下不同患者疗效和不良反应存在显著的个体差异。酮康唑的不良反应也较多, 主要为肝损害和过敏性疾病。因此, 伏立康唑和酮康唑的血药浓度监测具有重要的临床价值。 关于血浆酮康唑和伏立康唑的检测已有报道, 但同时检测这两种药物报道笔者较少见到。笔者在本试验中建立与评价同时检测人血浆酮康唑和伏立康唑的反相高效液相色谱法, 旨在为临床检测提供依据。 1 药品、试剂与仪器 甲醇和乙腈 (色谱纯, 天津市科密欧化学试剂开发中心) , 三氟乙酸 (TFA, Sigma, 064K3647) ;乙酸乙酯、正己烷、无水碳酸钠 (分析纯, 天津市化学试剂三厂) ;实验用水均为重蒸水 (本实验室自制) 。酮康唑标准品 (湖北纽兰药业有限公司, 纯度:99.5%, 批号:040302) , 伏立康唑对照品 (哈尔滨健迪医药科技开发有限公司, 纯度:99.8%, 批号:040401) , 卡马西平标准品 (Sigma公司, 批号:064K1653) 。 高效液相色谱仪为Agilent1100系列, 包括G1322A在线脱气机, G1311A四元泵, G1313A自动进样器, G1316A温控箱, G1315B二极管阵列检测器, Agilent 化学工作站[Rev A.10.02. (1757) ]。电子分析天平[AB204-A, 梅特勒-托利多 (上海) 仪器公司];涡旋混合器 (FZQ-2, 江苏泰县医疗器械厂) ;氮吹仪 (D10型, 杭州蓝焰科技有限公司) ;重蒸水仪 (1810-B型, 江苏金坛市科析仪器有限公司) 。 1.3 标准工作液和标准工作溶液的配制 ①准确称取酮康唑对照品25 mg置于25 mL量瓶中, 用甲醇溶解定容至25 mL, 得质量浓度为1 g·L-1的酮康唑标准储备液。用重蒸纯化水稀释成浓度依次为100, 10, 1 mg·L-1的标准工作液 (临用时稀释) 。②准确称取伏立康唑对照品25 mg置于25 mL量瓶中, 用甲醇溶解定容至25 mL, 得质量浓度为1 g·L-1的伏立康唑标准储备液。用重蒸纯化水稀释成浓度依次为100, 10, 1 mg·L-1的标准工作液 (临用时稀释) ;③准确称取卡马西平标准品25 mg置于25 mL量瓶中, 用甲醇溶解定容至25 mL, 最终质量浓度为1 g·L-1。然后用甲醇稀释成浓度为10 mg·L-1的内标溶液。 准确吸取三氟乙酸1 mL, 用重蒸纯化水稀释并定容至1 L。 色谱柱:Agilent TC-C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm, Agilent, USA) ;保护柱:TC-C18保护柱 (4.6 mm×12.5 mm, 5 μm, Agilent, USA) ;流动相:乙腈-0.1%TFA-水=40:20:40 (V/V/V) ;流速:0.9 mL·min-1;柱温:40 ℃;检测波长:0～6.5 min, 294 nm, 6.5～9.0 min, 256 nm。 准确吸取待测血浆样品1.0 mL置于10 mL具塞试管中, 加入10 mg·L-1卡马西平内标工作液25 μL, 混匀后加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液500 μL碱化血浆。再加入乙酸乙酯4.0 mL、正己烷1.0 mL, 涡旋混匀2 min。转移上层有机相于另一刻度离心管中, 氮吹仪中吹干。用300 μL流动相复溶, 取复溶液于自动进样器样品瓶中, 设定20 μL进样检测。 2 保留时间和内标保留时间 酮康唑和伏立康唑纯标、空白血浆、血浆标准等样品, 经HPLC分析测定得到色谱图。酮康唑保留时间为3.8 min, 内标的保留时间为5.6 min, 伏立康唑的保留时间为7.8 min。由图可见在本试验条件下, 酮康唑、内标卡马西平和伏立康唑的色谱峰能完全分离, 没有明显的内生杂质峰干扰。 2.2 回收率、精密度与定量下限 取8只10 mL具塞试管, 依次加入不同浓度不同体积的酮