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不同冷冻方法对卵巢皮质冻存效果的影响 随着生物冷冻技术的发展，卵巢组织冷冻作为保护女性生长的一种方法得到了迅速发展。陆续有羊、家兔、恒河猴等多种动物冷冻卵巢组织移植后恢复生殖力的报道,人类也有卵巢组织冷冻复苏后移植成功妊娠分娩的报道。但人类卵巢组织冻存,目前还处于研究的起始阶段,究竟哪种方法更适合人类卵巢组织冻存,尚无定论。 本研究采用4种方法,冻存家兔的卵巢组织,复苏后观察各级卵泡及卵巢组织结构形态学的改变,以探讨适宜的冷冻复苏方案,为人类卵巢组织冷冻保存奠定基础。 1 材料和方法 1.1 实验动物 选健康清洁级雌性日本大耳白家兔12只,4-5月龄,体重2.0-2.5 kg,由郑州大学医学院实验动物中心提供。 1.2 醇、蔗糖、人体白蛋白、hsa 丙二醇(PROH)、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、蔗糖(S)、磷酸盐缓冲液(PBS),Earl’s平衡盐溶液(EBSS)均购自美国Sigma公司,人体白蛋白(HSA)购自美国Sage公司。 1.3 产品的类型、培育和管理箱 CL-8000程序冷冻仪,澳大利亚Cryologic公司产品;2406-2型CO2培养箱,美国SHELLAB公司产品;各种型号培养皿、试管及0.5ml冻贮细管,购自美国Falcon公司。 1.4 小鼠booin氏液的组织学分析 将12只动物随机分为4组,每组3只,采用20%氨基甲酸乙酯,按5 ml/kg耳缘静脉推注麻醉,取双侧卵巢组织去除髓质,分别切成1-2 mm×1 mm×1 mm的组织块,每个动物随机取2-3块固定于Bouin氏液中作为新鲜对照组(A1-D1组)行组织学分析,其余分别进行PROH(A2组)及DMSO(B2组)慢速程序化冷冻和DMSO+PROH(C2组)及DMSO+EG(D2组)玻璃化冷冻。冷冻保存1个月,每只家兔分别取2-3块组织复苏,复苏后置37℃5%CO2培养箱中静止30 min,Bouin氏液固定,待行组织学分析。 1.5 冷冻修复法 分别参照Gook、Kim、Newtow及Hasegawa等的方法,稍加改进。 1.5.1 降低冷冻溶液 将卵巢组织块投入平衡液中(1.5 mol/L PROH+0.1 mol/L S+10 mg/ml HSA),室温平衡90 min,装入0.5 ml冻贮细管中置程序冷冻仪上,从室温开始以2℃/min降至-8℃,人工植冰,再以0.3℃/min降至-30℃,以10℃/min降至-120℃,投入液氮中冷冻保存。复温:冻贮细管插入37℃水浴中2-3 min后,室温中按1.0 mol/L PROH、0.5 mol/L PROH梯度递减洗脱冷冻保护剂,PBS冲洗3遍,将组织块移入含5%HSA的EBSS中完成复苏。 1.5.2 装管机冰降压 卵巢组织块投入含1.5 mol/L DMSO+0.1 mol/L S+1%HSA的PBS平衡液中,4℃平衡30 min,装管上机,从4℃开始以2℃/min下降至-7℃,10 min后人工植冰,持续5 min,以0.3℃/min,降至-40℃,再以10℃/min降至-120℃,投入液氮中冻存。复温:冻贮细管在空气中30 s,37℃水浴中2 min,依次放入1.0 mol/LDMSO、0.5 mol/L DMSO,室温梯度洗脱冷冻保护剂,将组织块移入含5%HSA的EBSS中完成复苏。 1.5.4 装管液氮中eg、dmso和pbs的安装 组织块放入含7.5%EG、7.5%DMSO、20%HSA的PBS中室温平衡15 min,再移入含15%EG、15%DMSO、0.5 mol/L S、20%HSA中的PBS中2 min,装管后直接投入液氮中保存。复温:冻贮细管直接插入到室温水浴中2-3 min,待冰晶融化后移入含1.0 mol/L S、20%HSA的PBS中,室温10 min,PBS冲洗3遍,移入含5%HSA的EBSS中待用。 1.6 组织结构观察 所有固定的组织块,经常规脱水、二甲苯透明、石蜡包埋,4μm连续切片,苏木精-伊红(HE)染色,根据Hreinsson的标准将卵泡进行分级。始基卵泡:单层扁平或扁平与立方混合的前颗粒细胞包绕卵母细胞。初级卵泡:单层立方型颗粒细胞包绕的卵母细胞。次级卵泡:两层或以上立方型颗粒细胞包绕卵母细胞。 光镜下观察各级卵泡及卵巢组织结构形态学的改变,记数正常形态及异常形态的始基卵泡、初级卵泡及次级卵泡,为避免重复记数,只有卵母细胞核存在的始基卵泡及初级卵泡被记数,此标准不用于次级卵泡。每10个组织切面分析1次。 1.7 统计分析 采用SPSS11.5统计软件,组间比较用χ2检验。 2 结果 2.1 新鲜家兔卵母细胞的he染色分析 4-5月龄进入性成熟期的家兔卵巢组织,主要含始基卵泡,其次为初级卵泡及次级卵泡。始基卵泡中央为一圆形的卵母细胞,直径约