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寡雄腐霉发酵条件优化及其对烟草黑胫病的生物活性 0 寡雄腐霉pythingonifen- [研究意义]黑胫骨病是中国烟草中常见的真菌疾病，发病率高、分布广泛、危害严重。化学农药的防治效果好, 但残效期长、残留量高, 大量施用不仅影响农产品安全性, 还导致土壤、水体、大气环境质量不断恶化。高效、安全地防治该病害是迫切需要解决的问题。【前人研究进展】目前防治作物病害的主要手段仍然是化学药剂, 能代替化学杀菌剂的生物农药较少。寡雄腐霉 (Pythium oligandrum) 定殖于多种重要经济作物, 是一种重要的重寄生菌, 能有效抑制20多种病原真菌的生长、繁殖, 预防和治疗相应病害。研究发现, 寡雄腐霉卵孢子接种于黄瓜根系周围, 不仅有效降低了根腐病, 而且提高了植株体内的生长素含量, 促进了生长和磷的吸收。寡雄腐霉产生的小分子物质既能抑制病原菌的繁殖生长, 激发抗病防御反应和诱导植物抗病能力, 又能促进植物的生理代谢和养分吸收, 刺激生长发育。欧洲发达国家已制备出对人畜和环境无毒且高度安全的寡雄腐霉卵孢子制剂, 广泛应用于绿色水果和蔬菜生产。【本研究切入点】由于大田应用卵孢子制剂时, 难以提供适宜的生存环境, 故效果不稳定。通过生物工程方法, 利用生防菌的次生代谢产物研制的生物制剂不仅可以提高防治效果, 还可克服微生物菌剂效果不稳定的缺点, 是研制生物农药的主要方向之一。目前, 中国尚无工厂化制备寡雄腐霉发酵液的菌株。【拟解决的关键问题】利用法国引进的寡雄腐霉发酵菌株, 研究培养基、温度、初始p H值、培养时间和光照等对寡雄腐霉菌丝生长和发酵液抑菌效应的影响, 为进一步分离、纯化、保活有效成分, 开展有关后续研究, 制备安全、高效的多功能生防制剂奠定基础。 1 材料和方法 试验于2009年3月至2011年9月在西南大学微生物实验室及实验农场完成。 1.1 真菌病害的防治 寡雄腐霉发酵菌株从法国科学家制备的卵孢子获得, 对于多种真菌病害均有良好的预防和治疗效果。烟草黑胫病菌、黑胫病中感和高感型红花大金元烟草种子由云南省烟草农业科学研究所惠赠。 1.2 试验设计 1.2.1 培养条件对接种法寡雄腐霉发酵的影响 将寡雄腐霉接种于PDA培养基, 25℃培养7 d备用。250 m L三角瓶装液量50 m L, 每瓶6片固体菌种 (菌丝直径=6 mm) , 分别研究培养基、温度、初始p H值、发酵时间和光照对寡雄腐霉菌株生长及其发酵液 (Pythium oligandrum fermentation broth, 简称POF) 对烟草黑胫病菌抑制率的影响。 (1) 培养基:工业发酵生产微生物次生代谢产物常选用原料来源广、成本低廉的天然培养基。为此, 试验分别以花生饼粉、黄豆饼粉、菜籽饼粉、棉籽饼粉为主要原料, 各取60 g于去离子水中浸泡5 h, 70℃水浴2 h, 过滤, 滤液加15 g葡萄糖, 定容至1 L, 分装灭菌。发酵条件为p H 5.0、25℃、150 r/min培养7 d, 筛选适宜培养基。 (2) 温度:真菌通常适宜在25—28℃生长。试验设置20、25、30、35、40℃5个梯度, 发酵条件为花生饼粉培养基, p H 5.0, 150 r/min培养7 d, 筛选适宜发酵温度。 (3) p H值:真菌通常适宜在p H 4.5—6.0范围生长。试验设置p H 3.0、5.0、6.0、7.0、9.0 5个梯度, 发酵条件为花生饼粉培养基, 30℃, 150 r/min培养7 d, 筛选适宜p H值。 (4) 发酵时间:试验设置3、5、7、9、11 d 5个时间, 发酵条件为花生饼粉培养基, p H 5.0, 30℃, 150 r/min, 筛选适宜发酵时间。 (5) 光照:考虑到光照是许多真菌生长发育的重要环境因子, 采用SPH-211B-GZ光照培养振荡摇床, 试验设置0、12、24 h·d-13种照光时间, 光照强度15 000 lx, 发酵条件为花生饼粉培养基, p H 5.0, 30℃, 150 r/min培养5 d, 研究光照对寡雄腐霉发酵的影响。 供试菌株发酵完成后, 8 000 r/min离心10 min得发酵液, 发酵液抑菌效应测定见1.2.3。所得菌丝80℃烘干至恒重, 差量法称重, 每瓶菌丝干重设置为菌丝生物量 (mg) 。每个处理5次重复。 1.2.2 利用正交试验确定各因素最佳值 根据上述单因素试验结果, 将最佳光照时间设定为固定培养条件, 以培养基、p H值、温度、时间为因素, 取各因素最佳值并选用L27(313) 正交表进行四因素三水平设计 (表1) , 菌丝生物量作观测指标, 进行发酵参数的优化试验。培养容器、接种方式和摇床速率等同1.2.1, 试验设置5次重复。 1.2.3 不同培养条件对烟