活体滋养层细胞微粒的体外制备及鉴定.docxVIP

活体滋养层细胞微粒的体外制备及鉴定 癫痫最初是一种多发性的多基因性疾病，通常发生在妊娠中后期。它以高血压、尿便和水肿为特征。在严重的情况下，心力衰竭、肾衰竭、脑血管疾病和dic为特征。这是妊娠中独特的并发症，严重威胁着母儿健康。迄今,子痫前期的病因学和发病机制尚未明确。自1941年Young提出子宫缺血学说以来,现代胎盘缺血缺氧学说已经有了很大进展。目前认为子宫缺血的实质是子宫螺旋小动脉重铸过程发生障碍引起的胎盘或滋养层细胞缺血,缺血再灌注损伤产生的毒性因子进入母体血液循环,损伤内皮细胞的功能,患者临床表现为子痫前期。近年来,由胎盘表面新陈代谢产生的妊娠期特有的循环微粒STBM得到了人们的关注。然而,虽然STBM可以在母亲血样本中检测到,但是却不能分离用于体外实验。本研究经过一段时间的摸索,建立了一种STBM的体外制备方法。 数据和方法 1. 样品收集 正常足月健康剖宫产孕妇胎盘娩出后立即置于4℃预冷含1%青链霉素的无菌PBS中,20分钟内送至实验室。 2. 人类睾丸中bca蛋白表达情况 JAI1003电子分析天平(上海天平仪器厂),CP100MX超速冷冻离心机(日立),青链霉素溶液(GIBCO),BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海钰森生物技术有限公司),人类胎盘碱性磷酸酶ELISA试剂盒(GBD)等。 3. 小鼠血液中的ca 取足月正常胎盘母体面2/3绒毛组织,去除蜕膜, 剪成2cm×2cm×2cm大小, 分别用0.1mol/L的CaCl2和PBS洗涤3次去除血液,再将组织剪成5mm大小的碎片,放入100ml的0.15M的NaCl中,4℃搅拌过夜。弃去组织,收集上清液。采用三步离心法,先1000g离心10min,去除大的细胞碎片,收集上清液10000g离心10min,去除线粒体及小的残存的细胞碎片,再收集上清液100000g离心60min,最后得到的乳白色沉淀即为合体滋养细胞微粒,沉淀重复洗涤离心2次,悬浮于1ml的无菌PBS中,-80℃保存待测。 4. stbm制剂及相应罪犯palp的测定 以胎盘碱性磷酸酶(placental alkaline-phosphatase PALP)作为膜标志酶,采用酶联免疫分析法检测STBM制剂及相应胎盘组织的PALP含量。 睾丸中palp蛋白的表达 正常健康剖宫产孕妇胎盘中PLAP含量为56μg/ml,由其制备而来的STBM中PALP含量为900μg/ml,STBM与胎盘组织PALP的含量比值显示,STBM的PLAP蛋白表达水平是相应胎盘组织的16.07倍。 子痫前期患者血清中stbm的变化情况 在生理或者病理状态下,真核细胞通过膜脱落释放囊泡到环境中形成微粒,其大体结构分为膜和膜内容物。微粒的膜主要由脂类和蛋白质组成,其成分取决于微粒的起源细胞和微粒的形成过程。微粒的膜为双层磷脂,表面有源自亲代细胞的特异膜抗原,可用来鉴别微粒的来源。最近的研究发现,微粒不只是简单的细胞脱落物,而是具有多种重要生物学信息的“载体”以及携带有多种生物学活性的分子,可参与炎症、感染、血栓、自身免疫疾病以及心血管疾病的发生。其中,由于胎盘表面新陈代谢,凋亡的合体滋养层细胞受调控地释放亚细胞微粒,脱落至母体血液循环产生的STBM得到了人们的关注。 STBM是妊娠期特有的循环微粒,从妊娠26天起,估计每天有10万个合体滋养层细胞微粒从绒毛表面掉下进入母体血液循环,随着妊娠的进展,胎盘滋养层细胞不断增殖和凋亡进行组织结构重建,胎盘体积增大,STBM脱落也增加。 正常妊娠妇女及子痫前期患者的血浆中均可以检测到STBM,但后者血浆中的表达水平更高。早发型子痫前期以及存在胎儿宫内生长受限但血压正常的孕妇中均有胎盘凋亡和/或坏死的增加,Goswami等通过比较两者血浆中STBM水平,发现STBM浓度的增加仅存在于前者,以此来说明STBM的浓度变化对于子痫前期患者来说是特异性的。临床发现相对于晚发型子痫前期而言,早发型子痫前期患者中不良母儿结局的发生率较高。陈宇等研究发现,早发型重度子痫前期患者血浆中STBM水平明显高于晚发型重度子痫前期患者血浆STBM浓度。Aly等也发现重度子痫前期患者血清中STBM的降解产物组织多肽抗原(TPA)水平明显高于轻度子痫前期患者血清中TPA水平。表明STBM参与子痫前期的发病过程,并且与该疾病的严重程度有关,可能参与子痫前期全身性炎症反应及内皮细胞的损伤。 虽然STBM可以在母体血液样本中检测到,但是却不能从中分离用于体外实验。为了进一步研究STBM与子痫前期发病的关系,我们必须体外制备出接近于子痫前期患者胎盘病理性释放的STBM。在体内,有两种途径可以产生微粒:细胞激活和凋亡。细胞受到刺激时,胞质Ca2+浓度升高,导致磷脂酰丝氨酸外化,细胞膜重塑。胞质Ca2+浓度增高还能激活钙蛋白酶,其能裂解