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拮抗果蔬腐霉的木霉菌株筛选及防效研究 腐菌病是植物病理学的重要病原体之一，导致各种作物的腐烂和突然倒下。尤其严重的是，这种疾病通常会导致大量的幼苗死亡并破坏栖息地。突然死亡稻草是烟草的一个重要疾病，由瓜果腐烂引起。播种期导致卷烟种子腐烂，不能发芽，苗期导致烟草丛生，旱期导致烟草根腐和茎腐。 为了克服长期采用化学药剂带来的环境污染和病原菌产生的抗药性,研制高效且对环境安全的生物杀菌剂成为新一代农药的发展方向.目前已发现许多微生物对植物病原真菌具有拮抗作用,木霉菌(Trichodermaspp.)就是一类具有开发应用前景的生防菌.本研究以瓜果腐霉为靶标菌,进行拮抗木霉菌株的筛选. 1 材料和方法 1.1 绿色木霉t.viride菌株的分离与鉴定 哈茨木霉(T.harzianum)菌株TGY040604,绿色木霉(T.viride) 菌株TG050601、TG050609、TZ050610,均由福建农林大学植保学院线虫研究室分离、纯化及保存. 1.2 烟低的分离纯化 采用诱捕分离法对腐霉菌进行分离:截取长约10 cm的烟杈,散布于烟畦上,待其上长满白色菌丝体后,带回实验室用玉米粉琼脂培养基(CMA)进行分离纯化.参照文献,根据腐霉菌的形态特征和培养性状进行种类鉴定. 1.3 培养腐霉菌 以烟草、黄瓜、辣椒的幼苗作为靶标作物,采用创伤接种法进行致病性测定,方法如下:用灭菌的四号注射针头将幼苗的根茎轻微刺伤,将在CMA培养基上培养4 d的腐霉菌培养物敷于伤口处,并用湿润的脱脂棉保湿,置于室内培养;定期喷水保湿.以只接CMA培养基为对照.每一处理3株幼苗,3次重复.并对发病植株进行再分离,以明确供试菌株的致病性. 1.4 生育木菌的筛选 1.4.1 培养机构设置 将各木霉菌株在PSA平板上培养4 d;用打孔器(直径为6 mm)打取病原菌菌饼,接于PSA平板(直径为9 mm)中央,置于28 ℃恒温培养箱中培养;采用十字交叉法测量菌落直径,直至某一菌株长满全皿为止.分别在木霉菌生长的第3、4、5 天测定产孢能力,用100 mL蒸馏水洗下孢子,于微型涡旋混合仪上振荡3 min,配制均匀一致的孢子悬浮液,吸取菌液于血球计数板上计数.每处理重复3次. 1.4.2 抑菌率测定 参照程丽云的方法,用打孔器(直径为6 mm)打取培养4 d的木霉菌和腐霉菌的菌饼;在距离PSA平板中心2.5 cm的相对2点上,分别接种木霉和腐霉菌;置于28 ℃恒温培养箱中培养,测量两接种点连线上腐霉菌的菌落半径,计算抑菌率.以不接木霉菌、只接腐霉菌的为对照.每一处理重复3次. 抑菌率/%=对照腐霉菌菌落半径?处理腐霉菌菌落半径对照腐霉菌菌落半径×100/%=对照腐霉菌菌落半径-处理腐霉菌菌落半径对照腐霉菌菌落半径×100 当两菌落接触后,观察记载木霉菌对病原菌的抑制、包围、侵入情形,及其占领腐霉菌生长空间的过程,挑取交接部位菌丝在显微镜下观察木霉菌与腐霉菌的相互作用. 1.4.3 接种腐霉菌饼、调湿饼的制备 参照文献的方法,在培养皿的底和盖上倒入等量(15 mL)的PSA培养基,制成平板;在盖上接种已活化4 d的木霉菌饼(直径为6 mm),在底上接种腐霉菌饼(直径为6 mm);将培养皿倒置于28 ℃恒温培养箱中培养,24、48、72 h后分别测量腐霉菌的菌落直径,计算抑菌率.以皿底只接腐霉菌、盖上不接木霉的为对照.每处理重复3次. 抑菌率/%=对照腐霉菌菌落直径?处理腐霉菌菌落直径对照腐霉菌菌落直径×100/%=对照腐霉菌菌落直径-处理腐霉菌菌落直径对照腐霉菌菌落直径×100 1.4.4 培养培养基的制备 参照文献的方法,将木霉菌接于PSA斜面上培养6-7 d,待其大量产孢后用灭菌水洗下孢子,采用血球计数法计数,配成106个·mL-1的孢子悬浮液;取1 mL上述孢子悬浮液加入装有100 mL PS培养液的250 mL三角瓶中,在28 ℃、180 r· min-1的摇床中培养5 d;过滤去除菌丝体,滤液用旋转蒸发仪蒸馏浓缩至原体积的1/4,浓缩液用灭菌的滤膜(直径为0.22 μm)过滤除菌;将无菌滤液与PSA培养基按1∶9的比例混匀后倒入平板,每皿15 mL;在平板中央接种培养4 d的腐霉菌饼(直径为6 mm),置于28 ℃恒温培养箱中培养,测量菌落直径,计算抑菌率.以不加木霉菌发酵滤液为对照. 1.5 烟苗的地面处理 腐霉菌孢子囊悬浮液的制备:将腐霉菌接于燕麦培养基上,置于28 ℃恒温培养箱中培养,待其产生孢子囊后用灭菌水洗下,配成104个·mL-1的孢子囊悬浮液. 取生长40 d左右、生长较为一致的烟苗,栽植于花盆中(18 cm×24 cm),每盆10株.设以下3个处理. 处理1:50 mL 107个·mL-1的木霉菌(TGY040604)菌液与50 mL上述孢子囊悬浮