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酮康唑对大鼠肝细胞的毒性效应 酮康唑（kcz）是第一种可以口服的咪唑类抗真菌药物。它可以抑制细菌膜的麦角醇的生物合成，影响细胞膜的渗透性，抑制细菌的生长。临床应用过程中发现其可以导致药物性肝炎的发生。动物实验表明,KCZ可以导致血清ALT和LDH活力的升高。目前,KCZ肝损伤机制尚不清楚。本研究采用大鼠肝细胞体外原代培养模型,观察KCZ染毒后大鼠肝细胞活力、胞内LDH泄漏量以及巯基的变化,探讨其可能的肝毒性机制。 1 细胞培养和量效关系 1.1主要试剂 KCZ原料药(批号:041204)由南京白敬宇制药有限责任公司惠赠。Ⅳ型胶原酶、William’s E培养液、HEPES、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)购自美国Sigma公司。胎牛血清购自德国Leonorenstr公司。 1.2动物 雄性SD大鼠体重180~220 g,(由军事医学科学院实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK-(军)-2002-001),常规条件饲养,试验前禁食12 h。 1.3肝细胞的分离 肝细胞的分离参考Seglen的胶原酶灌流法(两步灌流法),肝细胞混悬于William’s E培养液中),用体积分数为0.6%的苔盼蓝1∶1染色,以0.5×106/ml接种于铺被鼠尾胶原的25 cm2培养瓶中,以0.2×106/ml接种于铺被鼠尾胶原的96孔板中。培养48 h后用于试验。 1.4染毒方式 以0.05 mol/L稀盐酸为溶剂,在量效关系研究中,KCZ设56、75、94、113和188 μmol/L 5个组和溶剂对照组染毒时间4 h。在时效关系研究中,KCZ以188 μmol/L染毒,分别于染毒0、0.5、1、2和4 h后进行检测。 1.5检测指标 1.5.1细胞活力的测定:采用噻唑兰(MTT)比色法和中性红(NR)染色测定细胞活力。MTT参照Mosmann方法,NR参照Borenfreund方法进行检测。结果以与溶剂对照组比值的百分比表示。 1.5.2LDH活力检测:将培养液以3 00 g×5 min离心后,取上清,用全自动生化检测仪进行测定。 1.5.3总巯基(TSH)和非蛋白结合巯基(NPSH)的测定:参照文献进行TSH和NPSH测定。PSH(蛋白结合巯基)=TSH-NPSH。结果以μmol/L表示。 1.5.4原子力显微镜观察:肝细胞预培养48 h后,188 μmol/L染毒4 h,用不含血清的William’s E培养液荡洗后进行细胞表面形态的成像观测。 1.6统计学方法 实验数据以ˉx±s表示。应用SPSS10.0 软件进行单因素方差分析及相关性检验。 2 结果 2.1 检测指标结果分析 KCZ不同剂量染毒4 h后,随着剂量的升高,细胞活力和胞内巯基逐渐减少,培养液中LDH活力升高(表1,2),各项检测指标与染毒剂量之间存在一定的相关性(rMTT=0.857,rNR=0.863,rLDH=0.906,rTSH=0.899,rNPSH=0.946,rPSH=0.879,P均0.01)。 与溶剂对照比较,*P0.05,**P0.01;n=12。 与溶剂对照比较,*P0.05,**P0.01;n=3。 2.2 ldh活力变化 酮康唑在188 μmol/L剂量下,随着染毒时间的延长,细胞活力和胞内巯基逐渐下降,培养液中LDH活力不断升高(表3,4)。 与溶剂对照比较,*P0.05,**P0.01;n=12。 与溶剂对照比较,*P0.05,**P0.01;n=3。 2.3 核仁的组成,细胞间连接紧密 正常大鼠肝细胞原代培养后,在原子力显微镜下呈多边形,边缘清晰,有立体感,细胞间连接紧密,胞核呈圆形,内有单个或多个核仁。KCZ 188 μmol/L染毒4 h后,细胞立体感下降,细胞间连接模糊,细胞表面出现大量的大疱和凹陷,胞核消失(图1~2)。 3 kcz对大鼠细胞骨架功能的影响 本研究发现酮康唑可引起原代培养肝细胞活力下降,细胞表面出现大疱和凹陷,胞内LDH外漏,有明确的量效和时效关系。有文献报道,酮康唑可能通过抑制细胞色素P450LDM(羊毛甾醇脱甲基酶)的活力,使胆固醇前体物质羊毛脂甾醇和7-烯胆(甾)烷醇C-14位或C-4位的去甲基化过程受阻,导致哺乳动物细胞膜中重要成分——胆固醇缺乏,从而使细胞膜的结构和功能发生改变,膜的通透性增强,稳定性下降,结合在膜上的酶活力出现异常,胞内LDH外漏,细胞受损。 本试验中还观察到KCZ能够引起大鼠肝细胞内巯基物质明显减少。细胞骨架功能结构的改变是引起细胞表面大疱的最直接的原因,胞内Ca2+质量浓度升高和巯基减少是深层原因。巯基物质的降低改变了Ca2+转运系统中关键性-SH基团并抑制了Ca2+转运系统的功能,导致钙稳态改变,从而影响到细胞骨架的结构和功能,巯基物质的减少也可使骨架蛋白形成 二硫键复合物,直接破