烟草赤星病苗期接种方法研究.docxVIP

烟草赤星病苗期接种方法研究 植物病原体的人工再生是研究疾病、感染过程、发病机制、品种抗病性和疾病控制技术等关键疾病的必要试验手段。有关烟草赤星病菌的人工接种方法, 文献报道有菌丝块接种、孢子喷雾接种、孢子悬滴接种和孢子悬浮液棉球接种等4种。作者在烟草赤星病菌的有关试验中发现, 烟草赤星病菌在烟草苗期接种比较困难, 而且不同接种方法的接种结果往往相差较大, 这种情况严重影响试验结果的准确性和研究资料的可比性。鉴于上述情况, 作者以红花大金元 (简称红大) 和K326为供试烟草品种, 以烟草赤星病菌强致病力菌株GY-31为供试菌株, 在温室盆栽条件下, 对菌丝块接种、孢子喷雾接种、孢子液棉球接种、孢子悬滴接种和菌丝悬滴接种等5种接种方法的接种效果进行了比较试验, 旨在筛选并建立一个适于苗期采用的烟草赤星病接种方法。 1 材料和方法 1.1 lterana菌株gy-33菌株的鉴定 烟草赤星病菌 (Alternaria alterana) 菌株GY-31由安徽农业大学植物病原真菌学研究室提供, 系从安徽涡阳烟草赤星病病叶组织上分离鉴定获得。 1.2 燕麦麦片的制备 燕麦片培养基 (OMA) 配制参照方中达的方法, 略有改动。取30 g燕麦片加入少量水煮沸15 min, 4层纱布过滤, 滤液定容至1000 mL, 加入20 g琼脂加热, 待完全溶解后于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌30 min。 1.3 烟草种子种苗的放养 烟草品种K326和红大种子均由云南省烟科研所惠赠。两品种烟草种子在无菌土中发芽1周后, 将其幼苗移栽至含有复合肥的无菌土中, 在18～20℃的温室中培养至7叶期, 用于接种试验。 1.4 不同的接种方法的比较 1.4.1 处理配置 (1) 菌碟的制备 将供试烟草赤星病菌在OMA平板上光照培养7 d, 沿菌落边缘用直径为4 mm的打孔器打取菌碟, 均匀地放置在烟草最下部2片叶的脉间叶肉上, 每片叶上放5块菌碟, 并在菌碟上覆盖用灭菌水浸湿的脱脂棉保湿。 (2) 培养液液细 供试烟草赤星病菌在OMA平板上光照培养40 d后, 用灭菌水洗下, 4层纱布过滤, 取滤液用灭菌水将孢子浓度稀释至106个·mL-1;将制备好的106个·mL-1孢子悬浮液用小型喷雾器均匀地喷洒在烟草最下部2片叶片上。 (3) 赤星病菌细胞悬浮液的制备 取脱脂棉制作小棉球, 浸泡在106个·mL-1的赤星病菌孢子悬浮液中, 2 min后取出棉球均匀地贴在烟草最下部2叶片的脉间叶肉上, 每片叶上放置5个棉球。 (4) 菌悬滴菌注射 将制备好的106个·mL-1的赤星病菌孢子悬浮液用吸管均匀地悬滴在烟草最下部2片叶的脉间叶肉上, 每片叶上滴5滴悬浮液。 (5) 烟苗叶片悬浮液的制备 供试烟草赤星病菌在OMA平板上光照培养7 d后, 每皿加入20 mL灭菌水洗下全部菌落, 4层纱布过滤, 去滤液, 取菌丝体加入20 mL灭菌水, 在匀浆机中5000 r·min-1匀浆5 min, 即得到菌丝片段悬浮液。将制备好的菌丝悬浮液用吸管均匀地悬滴在烟草最下部2片叶的脉间叶肉上, 每片叶上滴5滴悬浮液。 每个处理接种10株烟苗, 3次重复。处理后, 保持室温在25～28℃之间, 相对湿度大于90%。 1.4.2 病斑直径、叶片及病叶率 接种赤星病菌11 d后, 调查烟苗发病情况, 记载病叶数、叶片病斑直径, 计算各处理平均病斑直径和病叶率。采用SAS统计软件对病斑直径数据进行方差分析, 多重比较采用Duncan′s 新复极差检验 (LSR test) 。 1.5 棉球接种法接种法 采用两因素随机区组设计。分别用浓度为104、105和106个·mL-1的孢子悬浮液以孢子液棉球接种法接种红大烟苗, 每个浓度处理接20株, 分为保湿和不保湿组 (每组10株) , 保湿组烟苗于接种后48 h内每4 h喷1次灭菌水, 不保湿组不作此处理, 3次重复。接种后, 保持温室内温度在25～28℃之间, 相对湿度大于90%。病情调查与数据分析同1.4.2节。 2 结果与分析 2.15 种植赤霉病的方法 2.1.1 不同接种法产生的病斑直径 接种赤星病菌11 d后对5种接种方法的接种结果进行了调查 (表1) , 结果表明, 在烟草品种红大上, 5种接种方法接种后所致的病斑直径以菌丝悬滴接种最大, 可以导致接种叶片迅速大面积枯萎;其次为孢子液棉球接种、孢子喷雾接种和菌丝块接种, 孢子悬滴接种几乎不发病, 所致的平均病斑直径仅达1 mm。从接种后所引起的病叶率来看, 菌丝块接种法最高, 为88.67%, 其次为孢子液棉球接种法 (67.00%) ;孢子喷雾接种法所致病叶率较低为22.33%, 孢子悬滴接种法所致病叶率最低, 仅为5.67%。 2.1.2 引起病害的病斑直径 从表2可以看出,