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烟草黑胫病防治内生细菌防治试验 黑胫骨草是草科病的重要疾病之一，可从苗期到高产期产生。生产上主要以化学防治为主,但化学防治易造成环境污染,而且药剂难以长期持续有效,所以探索生物防治途径,研发生防产品对烟草病害的防治显得尤为重要。利用有益微生物防治植物病害有效期长、保护环境,是近年来研究的热点,植物内生细菌分布于植株体内,生长繁殖相对稳定,是很好的生防菌资源,有些内生细菌还有促生作用。内生细菌用于植物病害的生物防治在水稻、棉花、玉米、蔬菜上已有报道,但在烟草上报道较少。烟草上主要是利用从根际分离的真菌、细菌来生物防治烟草黑胫病,但由于从根际分离的真菌、细菌定殖差,受环境条件制约,防效难以稳定,植物内生细菌能够克服以往从PGPR(根围促生细菌)中筛选生防菌的定殖差、受环境影响大的缺点。因此,进行了利用烟草内生细菌防治烟草黑胫病的研究。 1 菌株来源菌由健康烟株 供试品种K326,由云南省烟草科学研究院提供。供试菌种烟草疫霉菌(Phytophthora parasiticavar.nicotianae)由典型黑胫病烟株(采自重庆市綦江县)分离得到,内生细菌由健康烟株(采自四川省开江县、重庆市綦江县)的根、茎、叶中分离得到。 抗菌谱测定菌株:小麦纹枯病病菌(Rhizoctonia cerealis)、茄褐纹病病菌(Phomopsis vexans)、棉花立枯病病菌(Rhizoctonia solani)、烟草灰霉病病菌(Botrytis cicerea)、烟草炭疽病病菌(Collectotrichum nicotianae)、玉米小斑病病菌(Bipolaris maydis)、烟草赤星病病菌(Alternaria alternata)、棉花黄萎病病菌(Verticillium dahliae)均由西南农业大学植物生态病理研究所提供。 2 测试方法 2.1 细胞培养塑料样品 将烟草种子于28℃水中浸泡1d后,放在铺有湿润滤纸的培养皿中于28℃温度下催芽,3d后播于装有湿润细土的瓷盘里,上面再覆一层细沙,于20～26℃温室中光照培养,20d后移栽于装有沙壤土的塑料钵中,每钵1株,塑料钵的体积为0.21dm3,每10d加入1次Hoagland营养液,10mL/钵。烟苗培养至4～6叶期待用。 2.2 致病性力测定 采用髓部碟片法分离烟草疫霉,并作致病性测定和保存菌种,每6个月回接烟草1次,以恢复致病力。 从健壮烟草的根、茎、叶中分离内生细菌,得到纯菌株,转管保存待用。 2.3 烟草疫霉内生细菌抑菌带检测 初步筛选:用平板对峙培养法,在芝麻培养基平板上作对峙实验,平板中心接种烟草疫霉,菌块直径0.4cm ,周围对称接种待测内生细菌4个菌株,距菌块中心2.5cm,每个菌株重复3次,3d后观察有无抑菌带出现并记录。对有抑菌作用的菌株在芝麻蛋白胨培养基平板上做再次筛选。 2.4 温室疾病控制 2.4.1 d的制备 将活化的待测菌接种于100mLNA培养液中,在28℃温度条件下,120rpm振荡培养3d,稀释至浓度为1×108cfu/mL,每次施用10mL/株,灌根。 2.4.2 kno3溶液 刮取芝麻培养基上培养14d的菌丝,加入0.1%KNO3溶液浸润,产孢后加无菌水捣碎,调整孢子囊浓度为1×104个/mL,8℃条件下放置20min,稀释10倍后,加入1%的葡萄糖,接种待用。 2.4.3 烟苗温控疾病试验 2.4.3. 烟草疫霉的接种 选择平板抑菌效果较好的菌株进行温室盆栽控病试验。烟苗移栽时和接种病原菌前18d分别施1次待测菌,方法同2.4.1,以清水为对照,每处理3次重复,每重复12株,烟草疫霉接种为灌根接种,接种前用少量清水湿润土壤,每株用10mL接种菌液灌根。20℃黑暗处理24h,再在28℃、相对湿度80%～90%、光照(日光灯,4500LX,16h/d)条件下培养。7d后调查病情,0级为不发病,1级为植株死亡。 2.4.3. 菌株的施肥和接种 对控病效果较好的菌株进行3种施菌方式下的控病试验。Ⅰ、移栽时施1次待测菌;Ⅱ、移栽时施1次待测菌,接种病原菌前18d、7d各施1次待测菌;Ⅲ、移栽时施1次待测菌,接种病原菌前18d、1d各施1次待测菌,待测菌的施用方法见2.4.1节。 对照施用等量清水,烟草疫霉接种为灌根接种,方法见2.4.3.1。每种施菌方式设3次重复,每重复12株。 2.5 活化菌株的培养 采用平板对峙培养法,在PDA平板中心接种活化的待测菌,两边相距中心2.5cm处分别划线接种控病效果较好的活化菌株,设3次重复。28℃培养4d后,测定抑菌带的宽度。 2.6 识别菌株和其他疾病 对防效较好的菌株按文献介绍的方法进行鉴定。 3 结果与分析 3.1 内生细菌菌株 通过分离、培养、纯化、转管、保存,从烟草根、茎、叶中共获得238个内