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烟草青枯病菌接种烟草叶片的发病观察 卷烟旱涝是我国南方烟区最重要的疾病之一，每年给烟草业带来巨大的经济损失。因此，抗旱性文化的形成一直是湖南省第一位追求卷烟文化的目标。但在抗病育种过程中, 大田期对青枯病进行抗性鉴定往往由于气候条件不适宜发病而无法进行, 而苗期进行抗性鉴定则温湿条件较易控制。对烟草青枯病菌苗期抗性鉴定的最佳接种方法进行了探索, 现将研究结果报道如下。 1 材料和方法 1.1 红松林市,金朝ac 供试烟草品种为K326 (A) 、88-41 (B) 、红花大金元 (C) 。供试菌株为青枯菌Ps750 (湖南农业大学植病教研室提供) 。 1.2 方法 1.2.1 烟苗培育 自3月10日开始, 每隔10d播一批烟种, 共播3批。播后置于温室中培养。 1.2.2 悬浮液的制备 用红四氮唑青枯菌培养基移青枯菌株Ps750于温箱内30℃下培养。48h后, 洗配成悬浮液。通过云度计数法设置5个浓度, 即109、108、107、106、105cfc/ml。 1.2.3 茎部注射法 (1) 叶片注射法:用注射器针头先在叶片主脉两侧不完全对称的位置上各刺2~3下, 然后取下针头, 用注射器注孔抵压住已刺孔部位, 将配制好的青枯菌液注射至上下表皮之间。置于温室内, 每天喷水, 定期观察记载叶片注射区症状的变化。 (2) 茎部穿刺法:用四号注射器将准备好的菌液1.2.4 叶片发病症状分级:0级, 无明显症状;1级, 注射区褪绿变黄;2级, 注射区形成黄色坏死斑;3级, 注射区形成褐色坏死斑;4级, 注射区坏死斑明显扩展, 叶片萎蔫。 2 结果与分析 2.1 注射叶子 2.1.1 苗龄叶片发病鉴定 将Ps750配制成5个浓度, 即109、108、107、106、105cfc/ml, 注射接种烟草品种88-41的3~4叶期和5~6叶期 (不同批次) 的叶片 (顶部第2叶) , 对照接无菌水。每处理接种5片叶, 重复3次。温室测温白天为25~28℃, 晚上为15~19℃。接种10d后调查发病情况, 结果表明, 不同浓度对不同苗龄叶片的发病有影响。浓度为107~109cfc/ml时, 叶片发病症状3~4叶期为0.2~1.0级, 5~6叶期为0~0.6级;107cfc/ml时, 各苗龄叶片均不发病。这说明在同一条件下, 接种菌液浓度增大, 烟草发病加重, 烟草苗龄增大, 叶片抗病性增强。 2.1.2 发病情况调查 按2.1.1的接种法, 将已配制好的Ps750 5个浓度的菌液在各品种的3~4叶期叶片上分别接种。每处理5片叶, 重复3次。对照 (CK) 用无菌水。温室测温白天为25~28℃, 晚上为15~19℃。10d后调查发病情况, 结果见表1。由表1可以看出, 虽然3个品种发病均较轻, 但仍存在差异, 其中A (K326) 发病最轻, 其次是B (88-41) , C (红花大金元) 发病最重, 最高平均病级达2.0。 2.2 独立叶注射 2.2.1 小龄叶发病症状 将已配制的5个不同浓度的Ps750菌液按离体叶片注射法接种于88-41的大、小龄烟叶上, 对照 (CK) 用无菌水。每处理5片叶, 重复3次。温室测温白天29~32℃, 晚上21~24℃。6d后的调查结果表明 (表2) , 小龄叶发病症状比大龄叶重, 5个接种浓度均发病, 且整体发病程度比非离体叶片注射接种重, 发病所需时间也比非离体条件下的短。由此可知, 离体叶片注射接种法能更快更好地测定烟草苗期抗性。 2.2.2 材料6、84-33和麻黄大金属 将配制好的Ps750 5个不同浓度的菌液, 按离体叶片注射法分别接种于K326、88-41和红花大金元的小龄叶上, 其它设置同2.2.1。 6d后进行调查, 结果 (表1) 表明, C发病最重, B其次, A最轻, 这与前面非离体条件下鉴定的结果一致, 所不同的是3个品种在5个接种浓度下均发病, 较为理想。 2.2.3 温度对烟苗叶片发病的影响 用离体叶片注射法将5个浓度的菌液分别接种于88-41的小龄叶上。每处理10片叶, 重复3次, 对照用无菌水。然后置不同温度设置的光照培养箱中培养。发病后 (6d) 的调查结果表明, 温度升高, 叶片发病症状加重。在白天温度≥30℃时, 5个接种浓度处理均发病, 这说明在一定温度范围内, 温度越高, 烟苗叶片就越易发生青枯病。为此, 烟草青枯病菌苗期抗性的鉴定应选择在适当高温条件下进行。 2.3 烟苗的处理 将配制好的Ps750的5个浓度的菌液, 按茎部穿刺接种法分别接种于K326、88-41和红花大金元的烟苗 (3~4叶期) 上。每处理5株, 重复3次, 对照用无菌水。经过30d的温室保湿培养后, 3个品种均未发病, 解剖烟茎, 亦未见维管束变褐, 其原因有待探讨。 3 离体叶片注射法接种