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附子化学成分分析方法及药理作用研究进展 附子是毛科植物的乌拉科儿子根加工产品。其性热, 味辛, 有毒, 归心、肾、脾经。其主要功能是回阳救逆, 补火助阳, 驱风寒湿邪, 用于亡阳虚脱, 肢冷脉微, 阳萎, 宫冷, 心腹冷痛, 虚寒吐泻, 阴寒水肿, 阳虚外感, 寒湿痹痛。根据对附子中次生代谢产物研究表明其主要有生物碱、附子脂酸、附子磷脂酸钙、β-谷甾醇、脂肪酸酯等成分。生物碱类成分为附子主要有效成分且剧毒成分, 同时还发现非生物碱类成分如附子苷、尿嘧啶等强心成分。现代药理研究表明:附子具有多种药理作用, 如强心、升压、抗休克、抗血栓形成、抗缺氧、抗心肌缺血、抗缓慢性心律失常以及镇痛、抗炎、抗溃疡、抗腹泻和糖皮质激素样作用。为控制药材质量, 同时更好地运用于临床, 现将对附子化学成分分析方法及药理作用进行综述。 1 几种头皮碱的检测方法 随着分析技术的发展, 乌头碱类药物的检测方法有酸碱中和法、分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法 (HPLC) 和毛细管电泳法等, 其中HPLC因其柱效高、分离好、稳定方便, 能同时测定几种乌头碱的含量, 故应用最多。现将测定总生物碱、酯型生物碱、双酯型生物碱、双酯型生物碱水解产物分析方法进行综述。 1.1 酸性染料比色法 2005版中国药典中有关总生物碱的含量测定方法为中和滴定法, 文献中多采用酸性染料比色法。中和滴定法准确性、稳定性要优于紫外分光光度法, 但滴定法灵敏度较低, 测定所需样品量多, 而紫外测定操作步骤繁琐, 测定结果重现性较差。 1.1.1 回滴定法和紫外分光光度法 此法为测定生物碱的经典方法, 为2005版中国药典所采用。分为直接滴定法和回滴定法。直接滴定法终点突破不明显, 难于判断;回滴定法灵敏度低, 有较大误差。何军等研究发现同一样品, 采用滴定法和紫外分光光度法进行附子总生物碱的含量测定, 结果差异明显。从测定结果上看, 滴定法准确性、稳定性要优于紫外分光光度法, 但滴定法灵敏度较低, 测定所需样品量多, 而紫外测定操作步骤繁琐, 测定结果重现性较差。 1.1.2 分类测定总衍生物含量的方法 在适当的递质中, 生物碱类药物 (B) 可与氢离子结合成阳离子 (BH+) , 而一些酸性染料如溴百里酚蓝、溴酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫等, 可解离成阴离子 (In-) , 而上述的阳离子与阴离子定量地结合成有色离子对 (BH+In-) , 可以定量地用有机溶剂提取, 在一定波长处测定该溶液有色离子对的吸收度。李孝栋等采用此法测定定附子理中片中总生物碱含量, 方法良好, 结果准确, 可作为乌头类总生物碱的质量控制方法。余成浩等采用此法测定制川乌白芍配伍药对的不同配伍比例在水煎液环境中的总生物碱含量。侯大斌等用酸性染料比色法测定附子不同组织中总生物碱的含量。酸性染料比色法灵敏度高, 在测定小剂量或样品量较少时有优势, 专属性较好, 目前是一种测量总生物碱的较好的方法。但不足的是实验条件要求较严格, 实验操作和条件稍改变对结果影响较大, 需要找出一种更好的替代方法。 1.2 酯型氧化物含量测定 参照《中国药典》2005版一版制川乌项下进行含量测定, 酯型生物碱与羟胺反应生成异羟肟酸, 再与Fe+3生成紫红色的络合物, 进行比色。史亚军等采用此法测定骨刺消痛胶囊中酯型生物碱含量, 平均回收率为99.68%, 专属性强, 稳定性好。本方法实用、简便、特异性较强, 不需要高精仪器设备, 可做为质控方法。分光光度法对仪器要求低, 适合于常规检验工作, 但样品一般仅经简单分离, 采用乌头碱作为对照品, 某一波长下的生物碱含量, 选择性较差, 测定误差较大。 1.3 中药含量测定 单一的酯型生物碱含量测定一般有3种方法:薄层扫描法 (TLCS) 、反相高效液相法、高效毛细管电泳法等, HPLC法多为目前中药含量测定首选方法, 准确、实用, 易于普及。 1.3.1 流动相条件的影响 HPLC因其柱效高、分离好、稳定方便, 能同时测定几种乌头碱的含量, 故应用最多。紫外检测器 (UV) 是高效液相色谱法中最常用的检测器, 因其灵敏度高, 稳定性好, 线性范围宽等优点广泛应用。现国内外许多学者应用了C18柱不同的流动相条件来分离分析乌头类药材及制剂中乌头类生物碱的含量, 检测波长一般为235nm, 流速为1min·mL-1。现将其常用流动相系统与色谱柱归纳如下[13,14,15,16,17,18]: 1.3.2 高效液相色谱法 系指用一定波长的光照射在薄层板上, 对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描, 将扫描得到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方法。范时根采用此法测定附子中乌头碱, 用环己烷-乙酸乙酯-二乙胺 (10∶5∶1) 为溶剂上行展开, 喷雾改良碘化铋钾试剂,