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血细胞分离技术与大容量离心机的应用 血细胞分离技术大容量离心机采血 （一）材料与试剂 1．抗凝剂（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其钠盐或钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，从而阻止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为 1 000U/ml，市售肝素多为 100U~126U／mg。（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一种螯合剂。用生理盐水配制成 4％的溶液备用。 （3）阿氏液（Alsever 液），配方如下:枸橼酸钠（Na3C6H5O7·5H2O） 0.80g 枸橼酸 0.0325g 葡萄糖 2.05g 氯化钠 0.42g H2O 加至 100.00ml 混匀溶解后，114.3℃高压蒸汽灭菌 10min 备用。阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂，又含有细胞生存的营养，所以它既可做抗 凝剂，又可做血细胞的保存液。2．针头 根据不同动物和采血部位， 采用不同型号的针头，用前必须灭菌或消毒。3．采血容器 注射器或三角瓶等。4．采血动物。 （二）操作方法 1．采血法 各种动物采血方法不一。马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血， 家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或 四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或 剪断眼球采血。2．抗凝 采集血液最关键的问题是抗凝，采用什么方法进行抗凝，则根据实验的要求和条件而定。最常用的方法如下：（1）肝素抗凝：采血时，使每ml 血液含 15U~20U 肝素即可。计算采集 的血液量，按 1 000U/ml 的量加入肝素，直接放入采血容器中，采血时，边采血边轻轻摇动，使抗凝剂和血液混匀。对于采少量的血液或 小动物采血，可直接用注射器抽取一定量的肝素液，再采血直接抗凝。 （2）EDTA 抗凝：采血前，用灭菌生理盐水将EDTA 配制成 4％溶液，然后按预采血液的量，以每ml 血液加入 1mg~2mg 的EDTA 的液体量于采血容器内。采血，并不断摇动采血容器，使之混匀。（3） 玻璃珠法：预先将适量的玻璃珠（根据采血量多少而定）清洗后，装入采血容器中，灭菌后备用。采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本 法虽较麻烦，但对淋巴细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。 阿氏液采血：以阿氏液和采血量以 1︰1 比例采集血液，边采边轻轻摇动采血瓶，使之混匀。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于红细胞的保存。一般在 4℃条件下，阿氏液中保存的红细胞 2 周其活性和特性不变。 红细胞的分离技术 （一）材料与试剂 1．肝素等抗凝剂 2．3％明胶液 取明胶 3g， 溶于 0.9％灭菌盐水 100ml 中，114.3℃灭菌 10min，冷却后 4℃冰箱保存。临用时，37℃预热 10min。3．阿氏液 （二）操作方法 1．采血抗凝，即为红细胞。由于红细胞与白细胞的比例相差悬殊，一般白细胞混杂在其中，忽略不计。2．根据红 细胞的用途，可做进一步的处理。如计算红细胞，可直接稀释计数。 如需做补体结合反应，或其它溶红细胞反应，则需将红细胞进行充分的清洗，以除去附着在红细胞膜表面的血浆。一般用等渗的稀释液连续清洗，2 000r/min 离心 10min，重复 3~4 次。3．如需储藏备用， 则以阿氏液做抗凝剂采血，混匀后置4℃冰箱保存，可保存2 周，其活性尚可。 淋巴细胞的分离技术 （一）材料与试剂 1．淋巴细胞分层液有两种： （1）聚蔗糖— 泛影葡胺液：聚蔗糖,分子量 400 000，多配制成 40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。应用时，用蒸馏水配制9％溶液。泛影葡胺溶液，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基 2，4，6 三碘苯甲酸 1—去氧—甲氨基山梨醇。含量为 60％或 75％，每安瓶为 20ml 装，常用于人的脏器造影。应用时，取60％泛影葡胺原液 20ml，加双蒸馏水 15.38ml，即为 33.9％泛影葡胺。 1.077±0.001 聚蔗糖— 泛影葡胺的配制：9％聚蔗糖液 24 份 33.9％泛影葡胺液 10 份混合即可。必要时，可测比重。需要备用，可用 G5 漏斗过滤除菌或 114.3℃ 高压灭菌 15min，4℃保存。一般可保存 3 个月。如要配制不同比例的分层液，可按下列公式计算： 式中 dm 为分层液的比重，d1 和d2 分别为 9％聚蔗糖和 33.9％泛影葡胺的比重，V1 和V2 分别为它们的体积。如需配制1.077 比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液，则 9％ 的聚蔗糖和 33.9％的泛影葡胺的比例应为 100︰46.3。（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液 34％泛影葡胺液 10 份 60％右旋糖酐 液 12.5 份混合，即为比重 1.07～1