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植物过氧化物酶活性测定方法的探讨 “测定氧化酶活性”是一章植物生化呼吸作用中必须进行的实验内容。目的是让学生掌握构建发明法中植物氧化酶活性的原则和方法，了解植物氧化酶在植物生长发育和抗寒性环境中的作用。但是,在教学中,我们发现按照几种植物生理学实验指导书中的方法(白宝璋和汤学军1993;高俊风2006;王学奎2006)测定的植物过氧化物酶活性明显偏低。因此我们进行了如下的探讨和改进,与广大同行共切磋。 1 表12:表4 一般的植物生理学实验指导书中的过氧化物酶活性测定常用三氯乙酸(TCA)或偏磷酸(HPO3)n终止酶促反应(白宝璋和汤学军1993;高俊风2006;王学奎2006),我们发现这两种酸终止的光密度A470都显著降低(表1)。为了寻找合适的可用于终止反应的酸,在反应启动后3.5 min (即向反应体系加入酶液3.5 min后),除立即用TCA或(HPO3)n以外,我们还用H2SO4、HC1和H3PO4终止反应,与加酸前的对照(即反应3.5 min时的A470值)相比,其A470值有不同程度的降低(表1),加酸后由于稀释的原因A470的影响已经作了折算。说明在植物过氧化物酶活性的测定中,用酸终止反应是不适合的,否则测得的值即明显偏低,其原因可能是反应产物4-邻甲氧基苯酚在酸性环境中不稳定造成。这些结果表明一些实验指导书中用TCA或(HPO3)n,以及H2SO4、HCl和H3PO4终止反应值得商榷。 2 反应时间的影响 由于以酸终止酶促反应实验结果明显偏低,为了更准确地测定植物过氧化物酶活性,我们以愈创木酚为底物,反应体系中加入酶液后,每30s测定A470的增加值(即产物4-邻甲氧基苯酚形成的量)代表植物过氧化物酶活性的大小,以时间对ΔA470作图,得到过氧化物酶酶促动力学曲线(图1)。显示,在0～3.5 min内,随着酶促反应时间的增加,A470也随之增加,表现出较好的线性关系,符合比耳定律(A=KLC)的条件。但是,当反应时间超过3.5 min后,反应速度明显降低,不符合比耳定律。所以在过氧化物酶活性的测定中,如果反应超过3.5 min,必然导致实验结果不同程度的偏低,说服力不强。因此,我们认为应该以反应3 min计算酶活性。 3 两种方法的对比 为了检验“反应动力学法”测定植物过氧化物酶活性的有效性和可行性,我们以实验指导书中所用的实验材料马铃薯块茎和小麦根系为材料,与实验指导书中的“酸终止法”比较两种方法的结果(表2)表明,按照实验指导书中“酸终止法”测出的过氧化物酶活性明显低于“反应动力学法”。 综上所述,我们认为,在植物过氧化物酶活性的测定中,不能用TCA或(HPO3)n,以及H2SO4、HCl和H3PO4终止反应,否则其结果即会偏低;用“反应动力学法”,其反应时间0.5～3.5 min的A470值计算酶活性,这样的结果会更加准确。