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利用基因工程提高酿酒酵母半乳糖代谢刍s静;孟军;张建才淳B硕【摘要】为了提高酿酒酵母半乳糖利用速率,减弱葡萄糖阻遏半乳糖代谢，研究了负代谢调控基因GAL80,GAL6以及MIG1基因对半乳糖代谢的影响.通过重复利用loxp-KanMX-loxp抗性基因对GAL80,GAL6以及MIG1基因进行单敲除、双敲除及三敲除，共构建了7株工程菌株.结果表明,7株工程菌株的半乳糖利用速率、乙醇产率均加快.其中,GAL80和MIG1双敲除菌株FY-501a的半乳糖代谢速率为0.916g?(L?h)-1,较亲本提高44.71%,乙醇产率为0.329g?(L?h)-1,较亲本提高46.22%,而在FY-501a基础上继续敲除GAL6得到GY-501a,其半乳糖代谢速率以及乙醇产率均未见提高.7株菌的葡萄糖阻遏效应也得到减弱，其中FY-501a的葡萄糖阻遏效应较亲本减弱42.11%,其次为EY-502a,FY-502a和FY-503a,减弱31.57%.阻断半乳糖代谢途径的负调控基因可以加速半乳糖代谢、减弱葡萄糖阻遏交攵应. 【期刊名称】《河北科技师范学院学报》【年(卷)，期】2016(030)004【总页数】9页(P14-22)【关键词】GAL基因;半乳糖代谢;葡萄糖阻遏;MIG1;GAL80【作者】邹静;孟军涨建才;郭硕【作者单位】河北科技师范学院食品科技学院，河北秦皇岛,066000;河北科技师范学院食品科技学院，河北秦皇岛,066000;河北科技师范学院食品科技学院,河北秦皇岛,066000;河北科技师范学院食品科技学院,河北秦皇岛,066000【正文语种】中文【中图分类】S332.5工业上用糖蜜、木质纤维素生产乙醇时，酵母首先会将其分解成半乳糖和葡萄糖的混合物。对于酵母而言，葡萄糖是优势碳源，可以快速利用，而半乳糖作为酵母非常规碳源，葡萄糖的存在会抑制半乳糖的代谢，这就是所谓的葡萄糖阻遏效应。因此，半乳糖的代谢速度成为限制上述有机碳源利用的限速因素。 研究表明，酵母胞内半乳糖是通过Leloir途径进行代谢的，而该途径所需酶是由GAL系列基因编码［1~3］。GAL属于诱导调控型基因，由1个激活蛋白Gal4和3个抑制蛋白Gal8,Gal6和Mig1来调控［4~7］。本次主要研究MIG1,GAL80及GAL63个基因对酿酒酵母半乳糖代谢的影响，通过单敲除、双敲除及3个基因全部敲除共构建了7株转化子，通过对比这7株突变子的半乳糖代谢速率及葡萄糖阻遏情况，来分析阻断负调控基因在加速半乳糖代谢上的作用。 1.1菌株和质粒本实验所用的酵母菌株、大肠杆菌菌株及质粒列于表1,表2，其中pUC-MABK质粒用于敲除MIG1基因，pUC-G6ABK质粒用于敲除GAL6基因，pUC-G8ABK质粒用于敲除GAL8基因。 1.2主要溶液微量元素溶液：3g/LEDTA,0.09g/LCaCl2?2H2O,0.90g/LZnSO4-7H2Q,0.60g/LFeSO4?7H2O,200mg/LH3BO3,156mg/LMgCl2?2H2O,80mg/LNa2MoO4?2H2O;60mg/LCoCl2?2H2O,60mg/LCuSO4?5H2O以及20mg/LKI。用NaOH调pH值至4.0，高温蒸汽灭菌后备用。 维生素溶液：50mg/L生物素，200mg/L氨基苯甲酸，1g/L烟酸，1g/L泛酸钙，1g/L盐酸毗哆醇，1g/L维生素日1,以及25g/L肌醇，pH6.5，膜过滤后4°C储存。 1.3主要培养基LB培养基用于DH5a的培养；YEPD用于酵母菌的培养；重组子筛选培养基为YEPD中添加200pg/mL的G418。半乳糖培养基(成分为半乳糖60g/L,(NH4)2SO45g/L,KH2PO41g/L,MgSO4?7H2O0.5g/L,10mL/L微量元素溶液以及1mL/L维生素溶液)用于测定重组菌株半乳糖利用能力；葡萄糖培养基(成分为葡萄糖60g/L,(NH4)2SO45g/L,KH2PO41g/L,MgSO4-7H2O0.5g/L,10mL/L微量元素溶液以及1mL/L维生素溶液)主要用于测定重组菌株葡萄糖利用能力；葡萄糖阻遏培养基(成分为半乳糖30g/L,葡萄糖30g/L,(NH4)2SO45g/L,KH2PO41g/L,MgSO4-7H2O0.5g/L,10mL/L微量元素溶液以及1mL/L维生素溶液)用于测定重组菌株葡萄糖阻遏情况。 2.1质粒的构建以酿酒酵母AY5a基因组为模板，利用PCR技术分别扩增3个抑制子基因(GAL80,GAL6,MIG1基因)的上下游片段，通过限制性内切酶链接到受体质粒pUC19上。然后以pUG6为模板，扩增出loxp-KanMX-loxp卡那霉素抗性片段插入到已连接抑制子基因片段的质粒中，分别得到3个敲除质粒pUC-G8AB